Baixe Apostila de genetica classica da usp - texto13 e outras Notas de estudo em PDF para Engenharia Ambiental, somente na Docsity! 123 A DESCOBERTA DAS MUTAÇÕES Os relatos de De Vries (1901-1903, 1909- 1910) sobre o aparecimento freqüente de mutan- tes na planta Oenothera glazioviana (Onagra- ceae), abundante nas dunas da Holanda, estimu- laram muitos geneticistas e evolucionistas a procurar novos mutantes em outros organismos (veremos a seguir que os “mutantes”de De Vries não eram mutações verdadeiras, definidas por ele como uma mudança hereditária em um dos alelos de um gene). Era isto que Morgan tinha em mente quando iniciou suas culturas de D. melanogaster. Em espécies de Drosophila, assim como em qualquer outro organismo, o aparecimento de novos mutantes é um evento extremamente raro. Drosófilas com olhos brancos ou asas vestigiais só foram encontradas após a análise minuciosa de milhares de indivíduos. Em 1914, Morgan escreveu: “Na realidade, nossa experiência com Drosophila nos dá a impressão que as mutações são eventos raros, embora o número de mutações obtidas por nós até o momento tenha sido muito grande.” Existem duas razões principais para a raridade das mutações. Uma delas é a baixa freqüência MUTAÇÕES GÊNICAS E MUTAÇÕES CROMOSSÔMICAS Décima terceira aula (T13) Objetivos 1. Distinguir mutação espontânea de mutação induzida. 2. Conceituar gene letal. 3. Explicar como Morgan identificou mutações letais ligadas ao sexo em Drosophila. 4. Conceituar sistema balanceado de genes letais. 5. Definir inversão cromossômica. 6. Explicar como inversões em estado heterozigótico suprimem recombinação gênica. 7. Descrever as características do sistema ClB de Drosophila melanogaster. 8. Explicar a detecção de mutações letais ligadas ao sexo em Drosophila por meio do sistema ClB. 9. Conceituar mutação homeótica. Texto adaptado de: MOORE, J. A. Science as a Way of Knowing - Genetics. Amer. Zool. v. 26: p. 583-747, 1986. com que um determinado gene sofre mutação; a outra é a recessividade da maioria dos alelos mutantes. Como conseqüência dessa última situa- ção, a quase totalidade dos alelos mutantes encon- tra-se no estado heterozigótico, mascarados pelo alelo dominante selvagem. Imagine uma popula- ção de 1.000 moscas, em que haja apenas um alelo recessivo presente em um indivíduo hetero- zigótico, como seria possível detectá-lo? Durante as primeiras décadas do século XX, os organismos foram submetidos a diversos trata- mentos visando o aumento da taxa de mutação. Na esperança de obter novos mutantes, Morgan injetou várias substâncias químicas em diferentes espécies de insetos. Posteriormente, ele expôs drosófilas à radiação, idéia que deve ter vindo de seu colega da Columbia University, James Howard McGregor, que foi um dos primeiros a testar o efeito da radiação por rádio em organismos vivos (ele usou gametas e embriões de rãs). O fato de algumas das linhagens de D. melano- gaster de Morgan terem sido submetidas à radia- ção traz a remota possibilidade de que alguns dos primeiros mutantes descobertos possam ter sido induzidos por ela. Contudo, Morgan (1914a) não acreditava nesta hipótese e experimentos subse- 124 qüentes usando o elemento químico rádio e raios X pareciam não produzir mutações. Foram os tra- balhos de Muller que, posteriormente, demonstra- ram a capacidade mutagênica dos raios X. Mor- gan (1914b) também levantou a possibilidade da eterização das moscas causar mutações, mas não pôde demonstrar se isso realmente ocorria. E. B. Lewis (comunicação pessoal) acredita que seja pouco provável que os mutantes encontrados na “Sala das Moscas” tenham sido induzidos por radiação. Uma das razões para isto é que as dosa- gens de radiação usadas por Morgan eram muito baixas. Lewis suspeita que a causa da taxa elevada de mutações tenha sido a disgenesia do híbrido1 decorrente de numerosos cruzamentos entre dife- rentes linhagens de D. melanogaster coletadas no campo. Se essa hipótese for verdadeira, significa que o advento da genética de Drosophila foi um evento pouco provável. Se Morgan tivesse usado somente uma linhagem, quer de Lutz, Castle, Payne ou que ele próprio tivesse coletado, a disgenesia do híbrido não teria ocorrido e o fervilhar de mutantes não teria sido observado. Logo após o primeiro macho de olho branco ter sido descoberto, outros alelos mutantes apare- ceram. Em poucos anos o número chegou a 85. Isto se deveu, em grande parte, à extraordinária habilidade de Calvin Bridges para detectar varia- ções entre indivíduos com anomalias e o tipo sel- vagem. Na verdade, todos na “Sala das Moscas” tinham uma grande habilidade em descobrir novos alelos mutantes. Mesmo Sturtevant, apesar de daltônico, detectou muitos desses alelos. Um número enorme de moscas foi analisado e foi, muito provavelmente, a dedicação, o enfoque e a disciplina desses pesquisadores da “Sala das Moscas”, a maior razão para que tanto tenha sido descoberto em tão pouco tempo. Convém lembrar que as mutações somáticas não são hereditárias e apenas aquelas que ocorrem na linhagem germinal é que podem ser transmitidas às gerações subseqüentes. Portanto, as mutações somáticas são aquelas que ocorrem em qualquer célula que não aquelas que irão originar gametas. 1 Disgenesia do híbrido é um fenômeno que ocorre quando fêmeas de Drosophila melanogaster de linhagens de labora- tório são cruzadas com machos provenientes de certas popu- lações naturais. A progênie apresenta uma série de defeitos, incluindo esterilidade, devido à segregação distorcida na meiose (desvio meiótico), mutação e quebras cromossômicas. MUTAÇÕES INDUZIDAS A natureza e as causas do processo de mutação despertaram o interesse não só dos geneticistas mas também dos evolucionistas. Seriam as mudanças herdáveis estudadas na “Sala das Moscas” a base da variabilidade necessária à evo- lução darwiniana? A princípio, ninguém imaginava que as mudan- ças genéticas pudessem ser de tamanha magni- tude a ponto de serem reveladas por meio de investigações citológicas dos cromossomos. Mas, se a natureza física da mudança parecia não poder ser detectada, possivelmente, o processo da muta- ção em si pudesse ser estudado. Isto se tornaria plausível se as mutações pudessem ser produzidas experimentalmente. As evidências genéticas indicavam que muta- ção era um fenômeno raro. Muller, por exemplo, estimou que em D. melanogaster qualquer gene particular teria uma taxa de mutação da ordem de 1x10-6; ou seja, em uma amostra de 1 milhão de gametas seria esperado um portador de uma mutação nova em um gene particular. Foi veri- ficado também que: a taxa de mutação variava para diferentes genes; a mutação podia ocorrer em qualquer etapa da vida do organismo; a maio- ria dos alelos mutantes era recessiva; mutações com efeitos letais ocorriam com muito mais freqüência do que mutações com efeitos visíveis; um mesmo gene podia sofrer mais de um tipo de mutação, originando séries de alelos múltiplos que afetavam um mesmo caráter em graus variados; podiam ocorrer mutações reversas, ou seja, um alelo mutante mutar novamente restabelecendo a condição selvagem. A ocorrência de mutação reversa mostrou de forma clara e definitiva que a mutação era uma alteração no gene e não uma simples perda do gene. Com isso foi sepultada a chamada “hipótese da presença ou ausência”, proposta no início do século para explicar as relações entre os estados de caráter mendelianos. Segundo essa hipótese, um dos estados do caráter seria condicionado por um determinado fator e o outro, pela ausência do fator. Inicialmente, nenhum dos experimentos para induzir modificações genéticas foi conclusivo, uma vez que não se distinguiam as mutações indu- zidas das espontâneas e o planejamento dos expe- rimentos era inadequado. As mutações que apare- 127 Bd * * + Bd * * + X Bd * * + Bd * * + ➤ ➤ ➤ ➤ Bd * * Bd * * + * * +Bd * * +Bd + SelvagemBeaded BeadedMORRE Herança do alelo Beaded em condição não-balanceada P gametas F1 Bd * l + Bd * l + X Bd * l + Bd * l + ➤ ➤ ➤ ➤ Bd * * Bd * l + l l +Bd l * +Bd + Beaded BeadedMORRE Herança do alelo Beaded em condição balanceada P gametas F1 MORRE Figura 42. Herança do estado de caráter asas Beaded na condição letal não-balanceada e na condição letal balanceada. Homozigotos para o alelo Beaded não podem ser obtidos pois esse alelo é letal em homozigose. Uma homozigosidade aparente ocorre quando um alelo letal de um outro gene, sem efeitos visíveis, está presente no cromossomo homólogo ao que contém o alelo Beaded. Isso ocorre porque ambas as progênies homozigóticas morrem; uma por ter o alelo Beaded em homozigose e a outra por ter o outro letal em homozigose. (* = alelo selvagem; l = alelo mutante letal recessivo). INVERSÕES CROMOSSÔMICAS E A SUPRESSÃO DA RECOMBINAÇÃO GÊNICA Por volta de 1915, observou-se que alguns estoques de Drosophila melanogaster apresenta- vam uma taxa muito pequena de recombinação entre determinados locos. Este fato chamou a atenção dos pesquisadores da época, uma vez que a porcentagem de ocorrêrncia de recombinantes se constituia em um dado fundamental para a loca- lização de locos gênicos. A causa para a redução da recombinação, embora não fosse conhecida, era herdada e sendo assim poderia ser estudada. Imaginou-se a existência de um “fator redutor de recombinação” que seria herdado como um gene mendeliano simples. Este suposto fator estava localizado na região do mapa cuja recombi- nação ele afetava. Além disso, o suposto fator se expressava apenas na condição heterozigótica. Em 1926, Sturtevant publicou os resultados obtidos com moscas portadoras de um destes fatores que suprimia a recombinação entre genes localizados no braço direito do cromossomo III (fator CIII). Por meio de cruzamentos bem plane- jados, ele conseguiu determinar que a ordem de quatro dos genes presentes na região cromos- sômica onde a recombinação era suprimida não era a mesma que a do mapa gênico daquele cromossomo. Enquanto nas linhagens normais a ordem dos genes era ABCD, na linhagem porta- dora do “fator CIII” a ordem desses mesmos genes era ACBD. Sturtevant concluiu que este e, possivelmente, os demais fatores inibidores de recombinação eram inversões de regiões específicas dos cromossomos. Suponha um conjunto de locos hipotéticos que normalmente ocorrem ao longo do cromossomo na ordem abcdefg; um cromossomo que apresente estes locos na ordem abedcfg contém uma inversão. As inversões são formadas quando um cromossomo sofre quebras em duas partes, neste caso entre b e c e entre e e f, seguidas de uma rotação de 180o do segmento central e posterior fusão com as pontas terminais, b e f, do cromossomo original. Foi sugerido, então, que a recombinação era suprimida, porque durante a meiose os cromos- somos não podiam se emparelhar na região onde um dos homólogos contivesse a seqüência de locos normal e, o outro, a seqüência invertida. As observa- ções de cromossomos invertidos na meiose de milho e, mais tarde, em células de drosófilas com cromos- D. melanogaster. Portanto, os “mutantes” descritos por De Vries não seriam resultado de novas muta- ções, mas sim de permutações raras entre grupos de alelos normalmente mantidos em heterozigose. 128 somos politênicos mostraram, no entanto, que o emparelhamento cromossômico, em geral, ocorre e forma uma espécie de alça no bivalente. Nos segmentos invertidos emparelhados pode ocorrer permutação com formação de quiasmas e de cromátides recombinantes que terão consti- tuições distintas se o centrômero estiver situado dentro ou fora do segmento invertido. (Fig.43) a. Se a inversão não inclui o centrômero (inversão paracentromérica), a permutação originará uma cromátide sem centrômero e outra com dois centrômeros. A primeira não é puxada para os pólos onde se formam os núcleos-filhos; a segunda fica unida aos dois pólos celulares, formando na anáfase I da meiose uma ponte cromatídica que termina por se romper. Isso faz com que os únicos produtos viáveis dessa meiose sejam as cromátides que não sofreram permutação dentro do segmento invertido. b. Se a inversão inclui o centrômero (inversão pericentromérica), a permutação originará cromátides recombinantes com deficiência de alguns genes e com duplicação de outros. Os gametas que recebem estes cromossomos, em geral, não formam zigotos viáveis. Assim, não se formam recombinantes entre os genes conti- dos no segmento invertido. A Inversão pericentromérica em heterozigose Emparelhamento Meiose Final da meiose I Final da meiose II Duplicação de D Deficiência de A Com inversão Permutação na alça Produtos A B C D A C B D A B C D A B C A D B C D D B C A A B C D A B C A D B C D D B C A A A B C D B C D Duplicação de A Deficiência de D Normal ➤ ➤ ➤ ➤ Emparelhamento Permutação na alça Meiose Fragmento sem centrômero (é perdido) “Ponte cromossômica” (quebra em qualquer ponto) Produto com deficiência Produto com deficiência Produto normal Produto com inversão A B C D E A D C B E A B C D E A B C D E A D C B E A D C B E A D C B E A B C D E A B C D A A A B C D E D C B E A B C D A ➤ A B C D E B C D A E ➤ ➤ ➤ ➤ ➤ Inversão paracentromérica em heterozigose Figura 43. Permutações ímpares dentro da alça que se forma pelo emparelhamento entre cromossomos homólogos de indivíduos heterozigóticos para inversão paracentromérica (à direita) e para inversão pericentromérica (à esquerda). Como resultado da meiose formam-se dois cromossomos parentais e dois recombinantes cujos gametas resultantes são, em geral, inviáveis por possuírem deficiência ou duplicação de genes (extraído de Griffiths et al., 2.000). 129 O MÉTODO ClB DE MULLER A descoberta do sistema balanceado de genes letais e do efeito supressor de recombinação das inversões permitiu que Muller planejasse e cons- truísse uma linhagem especial de drosófilas chamada ClB. Com essa linhagem ele podia medir a taxa de mutação para o estado letal de genes localizados no cromossomo X. Uma fêmea ClB tem um dos seus cromossomos X portando uma grande inversão (C), um alelo recessivo letal (l) e o alelo dominante bar (B). Os loci l e B estão incluídos na região invertida C. Muller estrategicamente escolheu os genes l e B incluídos na região invertida C, pois assim eles permaneceriam ligados (a inversão “impediria” que eles fossem separados por permutação). O alelo dominante B serviria como um meio imediato de reconhecer as fêmeas heterozigóticas para o cromossomo ClB, pois é uma mutação dominante facilmente visível. As fêmeas portadoras de dois cromossomos ClB não seriam viáveis pois o alelo letal l entraria em homozigose levando-as à morte. Da mesma forma, os machos portadores do cromossomo ClB em hemizigose morreriam. Quando uma fêmea heterozigótica para o cromossomo ClB é cruzada com um macho selva- gem. A metade de suas filhas é selvagem e a outra metade tem os olhos bar, sendo, portanto, porta- doras do cromossomo ClB. Os filhos que recebe- ram o cromossomo ClB morrem por não possuí- rem o alelo dominante capaz de inativar o efeito do alelo letal l. A proporção sexual é, então, de 2 fêmeas para 1 macho. Como mencionado anteriormente, na época em que Muller estava fazendo estes experimen- tos, era sabido que genes em locos diferentes podiam mutar e causar a morte e que estes genes letais eram quase sempre recessivos. Já que diferentes locos podem mutar para um estado letal, a chance de se obter uma mutação letal qualquer é bem maior do que a de se obter uma mutação em um loco específico. Assim, se estu- darmos a taxa de mutação para uma condição letal do cromossomo X, estaremos estimando a soma das taxas para todos os locos que podem mutar de maneira a levar a prole de machos à morte. O número destes locos pode ser grande, mas não será conhecido. O estoque ClB permitiu a Muller medir a freqüência com que locos gênicos num cromosso- mo X de uma fêmea qualquer de D. melanogaster poderia portar um alelo letal. A intenção de Muller era determinar a taxa espontânea deste tipo de mutação e, com esta informação, testar o efeito dos possíveis agentes mutagênicos (por exemplo, do raio X). O método desenvolvido por Muller, esquema- tizado na figura 44, permite que seja estimada a freqüência com que ocorre uma mudança para o estado letal, de qualquer um dos alelos do cromos- somo X dos machos da geração parental; o l in- dica presença desta mutação. Note que o X do macho será transmitido para suas filhas. Se uma das filhas receber um cromos- somo X do pai com uma nova mutação letal, ela ficará com esse cromossomo e com o ClB recebi- do da mãe. Por que esta fêmea não morre, uma vez que ela possui um alelo letal em cada um dos seus cromossomos X? Neste caso, o gene letal recém- mutado não está no mesmo loco gênico, ou seja, não é alelo do gene letal presente no cromossomo ClB homólogo. Sendo assim, cada um dos alelos letais será inibido por um alelo normal presente no cromossomo homólogo. A confusão vem do fato de os dois alelos mutantes, embora em locos diferentes, receberem o mesmo nome “letal”. Como mutação é um fenômeno raro, a maioria das fêmeas F 1 receberá cromossomos X normais de seus pais e, portanto, elas só possuirão o alelo letal do cromossomo ClB. As fêmeas ClB da geração F 1 serão cruzadas com seus irmãos machos normais. Cada fêmea será, então, separada em um vidro de cultura in- dividual para que sua descendência seja analisada. Uma fêmea não portadora de mutação letal no cromossomo recebido do pai produzirá uma progênie constituída por 2 fêmeas para 1 macho. Metade das fêmeas será Bar (possuidoras do cromossomo ClB) e metade será selvagem; os machos serão todos selvagens, pois os que receberam o cromossomo ClB morreram. Como é mostrado na parte inferior da figura 44, uma fêmea F 1 que tenha recebido um cromos- somo X do pai com uma nova mutação letal produzirá apenas fêmeas na descendência: metade com fenótipo Bar (portadoras do cromosssomo ClB) e a metade com fenótipo normal, embora sejam portadoras do novo letal. Não haverá ma- chos. Metade deles morrerá por receber o cromos- somo ClB e a outra metade por receber o cromos- somo X portador da nova mutação letal.