Reações de Coloração e Precipitação de Proteínas, Exercícios de Química

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Sumário 1 ........................................................................................................................................ 2 Sumário........................................................................................................................... 1 3 ........................................................................................................................................ 4 OBJETIVOS...................................................................................................................... 2 5 INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 2 5.1 2.2 Estruturas.................................................................................................................. 3 5.2 2.2.1 Estrutura primária.................................................................................................. 3 5.2.1 2.2.2 Estrutura secundária.............................................................................................. 3 5.2.2 2.2.3 Estrutura terciária.................................................................................................. 4 5.2.3 2.2.4 Estrutura quaternária............................................................................................. 4 5.3 2.3 Reação da Ninhidrina................................................................................................ 4 5.4 2.4 Reação do Biureto..................................................................................................... 4 5.5 2.5 Precipitação de proteínas com desnaturação........................................................... 4 5.6 2.6 Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides ...................................... 5 5.7 2.7 Precipitação por reação com metais pesados........................................................... 5 5.8 2.8 Precipitação por reação com solventes orgânicos..................................................... 5 5.9 2.9 Efeito da força iônica sobre a solubidade (Sal�ng In)................................................ 5 5.10 2.10 Reações de precipitação sem desnaturação (Sal�ng Out)....................................... 5 6 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.................................................................................... 6 6.1 3.1 Materiais a serem u�lizados nos procedimentos a seguir........................................ 6 6.2 3.2 Reações de coloração de proteínas.......................................................................... 7 6.2.1 3.2.1 Reação com ninhidrina........................................................................................... 7 6.2.2 3.2.2 Reação do biureto.................................................................................................. 7 6.3 3.3 Reações de precipitação de proteínas...................................................................... 8 6.3.1 3.3.1 Reações de precipitação com desnaturação.......................................................... 8 6.3.2 3.3.2 Reações de precipitação sem desnaturação .......................................................... 9 7 RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................................................ 11 8 CONCLUSÕES.................................................................................................................. 13 OBJETIVOS A presente atividade experimental tem a finalidade de identificar e caracterizar a presença de proteínas em material biológico. Verificar, experimentalmente, a precipitação de proteínas com e sem desnaturação e relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais como estrutura e isolamento de proteínas. INTRODUÇÃO 2.1 O que são proteínas As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas células e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. São encontradas em todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e função celulares. Existem muitas espécies diferentes de proteínas, cada uma especializada para uma função biológica diversa. Além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas proteínas. Pertencem à classe dos peptídeos, pois são formadas por aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. Uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH 2 ) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma amida. São os constituintes básicos da vida: tanto que seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro lugar". Nos animais, as proteínas correspondem a cerca de 80% do peso dos músculos desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais as proteínas estão presentes. A importância das proteínas, entretanto, está relacionada com suas funções no organismo, e não com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por exemplo, são proteínas; muitas vezes, as enzimas existem em porções muito pequenas. Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as reações metabólicas e capacitam aos organismos a construção A temperatura é um fator importante na solubilização das proteínas. Em geral, entre O e 40°C o aumento da temperatura favorece a solubilidade. Isto decorre do fato do calor provocar um aumento da energia cinética das moléculas de proteína, facilitando a interação destas com o solvente. Entretanto, acima de 40°C, as proteínas começam a precipitar: os movimentos moleculares se tornam tão intensos que os grupamentos químicos se afastam além da distância permitida para se reassociarem, aproximando-se de outros com os quais se associam. Assim, ocorre o rompimento das estruturas secundária, terciária e quaternária e a proteína adquire outra conformação, uma conformação inativa (desnaturada). 2.6 Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides Os ânions de alcalóides (TCA) são capazes de se combinar com proteínas que possuam resíduos de aminoácidos na forma de cátions, formando complexos insolúveis que se precipitam e caracterizam a desnaturação. 2.7 Precipitação por reação com metais pesados Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento formador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa (ver determinação do ponto isoelétrico da caseína), favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. 2.8 Precipitação por reação com solventes orgânicos A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresenta constante dielétrica bastante elevada A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da conformação protéica. 2.9 Efeito da força iônica sobre a solubidade (Salting In) Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade em geral aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade “salting in”. 2.10 Reações de precipitação sem desnaturação (Salting Out) A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas é uma função de sua força iônica, que tanto depende de sua concentração como da valência de cátions e ânions que formam o sal. Em altas forças iônicas, conseguidas pela adição de grandes quantidades de um sal muito solúvel (por exemplo, o sulfato de amônio) a uma solução de proteína, pode ocorrer remoção de moléculas de água de hidratação das proteínas, o que leva à predominância das interações proteína-proteína, resultando em precipitação, fenômeno conhecido como salting-out 3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3.1 Materiais a serem utilizados nos procedimentos a seguir • 10 Tubos de ensaio • 01 Béquer de 50 mL • 04 pipetas graduadas de 5 mL • 04 pipetas graduadas de 2 mL • 01 pipeta graduada de 10 mL • 01 bastão de vidro • Estante para tubos de ensaio • Prendedor de tubos de ensaio (para aquecimento) • Pipetas de Pasteur • Peras • Bico de Bunsen • Caneta hidrográfica • Pisseta com água destilada 3.2 Reações de coloração de proteínas 3.2.1 Reação com ninhidrina Reagentes: • Solução de ninhidrina a 0,1% em tampão fosfato pH 7,0 (10mM) • Solução de proteínas: clara de ovo a 10% v/v e, solução salina 0,9% • Solução de glicina 0,1% Procedimento: • Numerou-se 02 tubos de ensaio em que no primeiro adicionou-se 2 mL da solução de ninhidrina e 5 gotas de proteínas e aqueceu em chama direta durante aproximadamente 2 minutos. Observou-se o aparecimento de coloração; • No segundo tubo de ensaio colocou-se 2 mL da solução de ninhidrina com 5 gotas de glicina e ferveu em chama direta durante aproximadamente 2 minutos. Observou aparecimento de coloração. 3.2.2 Reação do biureto Reagentes: • Solução de hidróxido de sódio 2,5 M • Solução de sulfato de cobre 1% • Solução de proteína: clara de ovo a 10% v/v em solução salina 0,9% • Solução de glicina 0,1% Procedimento: - Solubilização (“salting in”) Procedimento: • Colocou-se em um béquer 3 mL de clara de ovo e diluiu-se este com um pequeno volume de água destilada, sob agitação suave com o bastão de vidro até o aparecimento de precipitado. Após foi adicionado gota a gota a solução de NaCl até a redissolução deste precipitado. - Precipitação (“salting out”) Procedimento: • Pipetou-se 2 mL da solução do procedimento anterior (“salting in”) em um tubo de ensaio.Foi adicionado 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio e observou a formação de um precipitado. Após colocou-se de 6 mL de água destilada até a redissolução deste precipitado. 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 1. – Reações de coloração de proteínas 1.1.. – Reação com ninhidrina Tabela 01 – Dados experimentais reação com ninhidrina. Tubos Evidências 01 Logo no inicio do aquecimento observou-se a mudança de coloração da solução que antes era incolor e tornou-se violeta opaco (tom claro) 02 Observou-se a mudança de coloração da solução que antes era incolor e tornou-se violeta opaco (tom escuro, quase azul) 1.2.. – Reação do biureto Tabela 02 – Dados experimentais reação com biureto Tubos Evidências 01 Observou-se a mudança de coloração: de incolor para violeta transparente. Portanto, a resposta é positiva para a reação – precipitação de proteínas 02 Observou-se a mudança de coloração: de incolor para azul opaco (tom claro) 03 BRANCO. Observou-se novamente a mudança de coloração: de incolor para azul opaco (tom claro) Comparação das reações do tubo 2 com o 3: O tubo 03 é o branco, ou seja, o teste com os reativos necessários para precipitação de proteínas, mas sem as proteínas presentes, apenas para comparar caso os testes sejam positivos (precipitação de proteínas – cor violeta) ou negativos (não precipitação de proteínas – cor azul). O tubo 02 apresentou a mesma coloração do branco, entretanto o sistema do tubo 02 continha 1 mL de glicina que é o aminoácido mais simples que existe e portanto ele tem grupamentos amina disponíveis para reação. Figura - Estrutura da Glicina 2. – Reações de precipitação de proteínas 2.1.. – Reações de precipitação com desnaturação Tabela 03 – Dados experimentais das reações de precipitação com desnaturação Reações – precipitação Evidencias Ação do calor Com pouco aquecimento já se observou a formação do coagulo de coloração branca leitosa Reagentes para alcalóides No momento da adição já se observou a formação do precipitado de coloração branca Sais de metais pesados Observou-se a formação do precipitado na forma de pequenos fios, mas a solução continuou com cor inicial Solventes orgânicos Com a adição de 1 mL já foi possível observar a formação do precipitado de cor branca (aspecto leitoso) 2.2.. – Reações de precipitação sem desnaturação (efeito força iônica sobre a solubilidade das proteínas)