Diagnóstico de Infecções Respiratórias Agudas Virais em Crianças: Tecnologias e Métodos, Notas de estudo de Enfermagem

Baixe Diagnóstico de Infecções Respiratórias Agudas Virais em Crianças: Tecnologias e Métodos e outras Notas de estudo em PDF para Enfermagem, somente na Docsity! SECCIÓN I 91 CAPÍTULO 5 OS VÍRUS COMO CAUSA DE IRA ALTA E BAIXA EM CRIANÇAS: CARACTERÍSTICAS GERAIS E DIAGNÓSTICO Professora Mercedes C. Weissenbacher e Dra. María M. Ávila I. INTRODUÇÃO A s infecções respiratórias agudas (IRA) do trato respiratório inferior são uma das principais causas de mortalidade de crianças no mundo, particularmente nos países em desenvolvimento, causando aproximadamente um terço de todas mortes estimadas em crianças menores de 5 anos (1). Entre os numerosos agentes etiológicos descritos, os vírus são reconhecidos como os agentes etiológicos predominantes nas IRA (2), tanto em crianças quanto em adultos, seja em países em desenvolvimento ou nos países industrializados (3). Ainda que se postulasse que nos países em vias de desenvolvimento a etiologia bacteriana era a predominante nas IRA (4), em um estudo multicêntrico internacional coordenado pelo Board on Sciences and Technology for International Development da National Academy of Sciences dos Estados Unidos, determinou-se que a etiologia viral está presente em maior proporção que a bacteriana (5), variando as porcentagens de identificação viral segundo o país entre 17 e 44% das IRA em crianças menores de 5 anos. Os vírus isolados mais freqüentemente foram o vírus sincicial respiratório (VSR), entre 11 e 37% do total dos casos estudados; o adenovírus, entre 1 e 7%, os parainfluenza 1 e 3, entre 1 e 11%; e os influenza A e B, entre 1,4 e 4,3% (6-9). Demonstrou-se que o mesmo quadro clínico pode ser causado por diferentes agentes e o mesmo agente é capaz de causar uma ampla gama de síndromes. Os vírus mais comuns nas IRA altas são os rino e corona; e nas IRA baixas os influenza, parainfluenza, VSR e adenovírus (Quadro S e ç ã o I I : A s p e c t o s e t i o l ó g i c o s aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 91 Infecções respiratórias em crianças92 1). No entanto, outros vírus além dos mencionados podem causar afecções respiratórias altas ou baixas em crianças; entre eles pode-se mencionar o Herpes simplex, o Epstain-Barr (EBV), o vírus do sarampo e o da parotidite. A infecção viral pode causar por si mesma uma doença leve ou grave ou pode complicar-se favorecendo uma posterior infecção bacteriana (10). A pneumonia viral é mais comum que a pneumonia bacteriana, mas o risco de morte é consideravelmente menor (11). II. DIAGNÓSTICO DAS IRA VIRAIS O diagnóstico etiológico das infecções respiratórias virais é feito tradicionalmente mediante a detecção do agente etiológico durante a doença ou pela determinação de um aumento do título de anticorpos durante a convalescência. Tal diagnóstico é complexo devido à grande variedade de agentes que causam as IRA, mas foi simplificado grandemente com as metodologias existentes para a detecção direta do vírus no aspirado nasofaríngeo (12). O isolamento em culturas celulares mais a identificação por técnicas imunoquímicas é considerado o método de eleição ou padrão para o diagnóstico virológico. Entretanto, é um método custoso e relativamente lento (às vezes leva mais de uma semana). Um encurtamento do tempo de obtenção de resultados da cultura viral foi obtido com a centrifugação a baixa velocidade das culturas celulares inoculadas com a amostra mais a identificação posterior por imunofluorescência. A tecnologia tem avançado rapidamente no que concerne ao diagnóstico das infecções respiratórias virais, ainda mais que para as bacterianas, conduzindo ao desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico viral suficientemente rápidas, sensíveis e específicas. Além disso, como resultado do desenvolvimento de quimioterápicos antivirais como a amantadina contra influenza, o ribavirin contra o VSR e outros que estão em teste, faz-se cada dia mais necessário um diagnóstico etiológico acertado e rápido para o manejo do paciente. Nos últimos anos foram desenvolvidos métodos de diagnóstico direto que permitem detectar em poucas horas a presença de vírus em amostras clínicas. Estes procedimentos são a imunofluorescência (IF), tanto direta como indireta; o imunoensaio enzimático (ELISA) de similar sensibilidade; o imunofluoroensaio de resolução por tempo (TR-FIA); a reação em cadeia da polimerase (PCR) e a hibridação de ácidos nucléicos. Estes métodos podem dar um diagnóstico entre as 4 e 24 horas posteriores à extração da amostra. Os métodos sorológicos de detecção de anticorpos antivirais não são os de eleição para o diagnóstico de infecções respiratórias devido à sua baixa sensibilidade e ao fato de que a resposta imune-humoral a estes vírus que não produzem viremia é, no geral, de escassa magnitude. Por outro lado, a necessidade de usar amostras pareadas de soro (ou seja, amostras do período agudo e do período de convalescência) faz com que o resultado não influa no controle terapêutico do paciente. De toda maneira, o diagnóstico sorológico é útil em estudos epidemiológicos, na avaliação de vacinas e em ensaios clínicos de novos antivirais, nos quais é importante detectar tanto infecções clínicas como subclínicas. Em geral, a técnica ELISA para detectar anticorpos IgG em soros pareados é um método sorológico mais sensível para diagnosticar as IRA de origem viral. aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 92 b.3) Ensaio imunoenzimático (ELISA) Os métodos imunoenzimáticos para a identificação de vírus respiratórios têm sido desenvolvidos nos últimos anos com resultados variados e são utilizados para a detecção de antígenos em amostras clínicas. Emprega-se o princípio do sanduíche, agregando-se as amostras a tubos ou placas de plástico especial nos quais se fixou o anticorpo de “captura”, dirigido contra o antígeno que se busca. Em seguida agrega-se outro anticorpo específico contra o antígeno, mas marcado com uma enzima (as mais usadas são a peroxidase e a fosfatase alcaline). A atividade enzimática é detectada ao agregrar o substrato, por uma mudança de coloração que pode ser lida visualmente ou com um leitor de ELISA. Os anticorpos monoclonais melhoraram a sensibilidade e especificidade destes métodos e contribuíram para difundir o uso do ELISA como método de diagnóstico (20-23). Este método também pode ser utilizado para a detecção de anticorpos no soro. b.4) Hibridação com sondas Um enfoque diagnóstico mais recente está dirigido à detecção de genomas virais por hibridação com sondas de ácidos nucléicos específicos para a detecção de vírus. A sonda marcada é aplicada à amostra clínica e se existe uma cadeia complementar de ácido nucléico viral ocorre a hibridação que é detectada segundo o sistema de marcação empregado (sondas radioativas ou biotinizadas). Estas sondas podem ser preparadas por diferentes métodos que dependem fundamentalmente do vírus a ser investigado. Nos últimos tempos a tendência tem sido utilizar clones de ácidos nucléicos recombinantes ou oligonucleotídeos sintéticos que representem seqüências específicas do genoma viral de interesse (3, 24, 25). b.5) Reação em cadeia da polimerase (PCR) Este método permite detectar quantidades muito pequenas de vírus, mediante a amplificação de seqüências do ácido desoxirribonucléico (DNA) genômico viral presente na amostra. O processo requer o uso de oligonucleotídeos complementares de seqüências genômicas conservadas do vírus denominadas primers e de uma enzima DNA polimerase termoestável. Como resultado da reação, são obtidas milhões de cópias a partir de uma única seqüência do DNA viral que logo podem ser detectadas a olho nu (por meio do tingimento com brometo de etídio) ou por meio de hibridação (radioativa ou enzimática). A utilização da mesma ainda é experimental, especialmente para o vírus da influenza, o VSR e o enterovírus (3). b.6) Imunofluoroensaio de resolução por tempo (TR-FIA) Este método, desenvolvido recentemente para a detecção de vírus respiratórios, é até o momento o ensaio em fase sólida mais sensível. Permitiu aumentar a sensibilidade da fluorescência ao eliminar a fluorescência inespecífica de fundo e conseguir uma 95Os vírus como causa de IRA alta e baixa em crianças: características gerais e diagnóstico aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 95 Infecções respiratórias em crianças96 fluorescência de maior intensidade e tempo de queda com o uso de quelato de európio. Sua simplicidade e rapidez derivam do fato de que a amostra é incubada simultaneamente durante apenas uma hora, com o anticorpo de captura e o anticorpo específico marcado com o quelato de európio. O alto custo do equipamento requerido limitou seu uso aos laboratórios de referência (3). III. VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO (VSR) Vírus da família Paramixoviridae, do gênero pneumovírus. O virião é pelomórfico, tem invólucro e seu diâmetro varia entre 150 e 300 nm (26). O ácido nucléico do VSR é uma cadeia simples de RNA de polaridade negativa. Não possui atividade de hemaglutinação, nem de hemadsorção, hemolítica ou neuraminidase. É muito sensível às mudanças de temperatura, o que deve ser levado em conta quando se pretende isolá-lo em culturas celulares. Até o momento, existe a descrição de um sorotipo de VSR e pelo menos duas variantes antigênicas ou subgrupos (A ou 1 e B ou 2). A maior diferença entre os subgrupos reside na glicoproteína G. Ambos circulam simultaneamente na população e não está clara a importância clínica ou epidemiológica destas variantes antigênicas (27-29). É provável que a diversidade antigênica dos dois subgrupos de VSR tenham alguma influência na susceptibilidade das crianças à infecção seqüencial com os mesmos. Em alguns países foram demonstrados recentemente padrões epidêmicos que alternam os subgrupos A e B em ciclos de 2 anos (3). O período de incubação da doença respiratória é de quatro a cinco dias. O vírus se replica na nasofaringe e pode permanecer até três semanas na criança infectada. O mecanismo pelo qual o vírus se estende desde as vias altas ao trato respiratório poderia ser através do epitélio respiratório ou pela aspiração das secreções infectadas. Até agora, não se detectou viremia (26). Parece ser necessário um sistema imunológico intacto para se terminar com a infecção, apesar de que a infecção em crianças possa ocorrer inclusive na presença de anticorpos maternos. São comuns as reinfecções em todas as idades, ocorrendo algumas vezes a poucas semanas uma da outra (30). Encontrou-se evidência da infecção por VSR em todas as áreas geográficas estudadas. Epidemias anuais ocorrem comumente durante os meses frios. Durante as epidemias há um aumento do número de casos de bronquiolites e pneumonias e um aumento de internação de crianças pequenas por infecção de vias respiratórias baixas. Antes de começar a etapa escolar (entre os 4 e 5 anos), a maioria das crianças já se infectou com VSR. A idade, o sexo e as condições socioeconômicas influem na gravidade da doença, mas não na taxa de ataque. A bronquiolite é a entidade mais comum causada por este vírus, sendo mais freqüente entre as 6 semanas e os 6 meses de idade. Esta doença é pouco freqüente durante as primeiras 6 semanas de vida (31). A infecção primária com o VSR pode se manifestar como uma infecção respiratória baixa, como pneumonia, bronquiolite, traqueobronquite ou infecção respiratória alta muitas vezes acompanhada por febre ou otite média. A infecção é raras vezes assintomática. A pneumonia e bronquiolite podem ser difíceis de diferenciar e muitos lactentes parecem ter ambas as síndromes (32). O VSR causa epidemias que afetam a uma proporção muito alta de crianças, algumas das aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 96 97 quais devem ser hospitalizadas. Estas crianças excretam altos títulos de vírus durante vários dias, o que provoca freqüentes infecções nosocomiais, especialmente em alas de lactentes. Estas infecções podem manifestar-se desde a forma de doença febril leve das vias aérea altas, até um quadro com grave comprometimento respiratório baixo e morte subseqüente (32). Em adultos infectados com VSR, a doença pode manifestar-se em vias aéreas altas ou baixas e nos idosos pode causar broncopneumonias. O VSR cresce em uma grande variedade de células de origem humana e animal. As linhagens nas quais se pode isolar o VSR são Hep-2, Hela, Vero, LLC-MK2, MRC-5, BSC-1 e CV-1 e também em culturas primárias de rim bovino ou de rim de embrião humano. O vírus induz à formação de sincícios característicos em células Hep-2 (23, 26). A imunofluorescência direta e indireta com anticorpos poli ou monoclonais demonstrou ser de grande utilidade para a detecção de antígenos do vírus nas células de descamação naso-faríngea (17, 18, 33). O método ELISA permitiu identificar amostras positivas, demonstrando uma eficiência semelhante à da imunofluorescência. Esta prova pode detectar entre 20 e 30 ng de proteína viral (20). Atualmente, existem kits comerciais que, ao serem avaliados deram valores distintos de sensibilidade e especificidade (21, 23). Realizam-se ensaios utilizando a reação em cadeia da polimerase e sondas de ácidos nucléicos para detectar VSR em amostras clínicas, assim como a detecção da nucleoproteína viral mediante a aplicação de anticorpos monoclonais com a técnica TR-FIA (3). IV. ADENOVÍRUS A família Adenoviridae compreende um grande número de espécies de origem humana e animal que estão amplamente distribuídas na natureza. A classificação atual agrupou os numerosos membros da família em dois gêneros: mastadenovírus e aviadenovírus. O gênero mastadenovírus inclui os adenovírus humanos e muitos outros isolados de diversos animais. Todos eles caracterizam-se por serem específicos de sua espécie hóspede e por apresentarem uma grande variabilidade genética. Em geral, infectam a seus hóspedes através da conjuntiva ocular ou da mucosa digestiva. Até o presente foram reconhecidas 47 espécies ou sorotipos diferentes de adenovírus humanos (34). Desde seu descobrimento por Rowe em 1953 (35), foram utilizados distintos critérios para a classificação destes agentes, ficando agrupados finalmente em seis subgêneros (do A ao F). Todos os adenovírus apresentam a mesma estrutura geral: partículas virais de simetria icosaédrica, sem invólucro e com um diâmetro médio de 80 nm. O genoma viral é o DNA bicatenário. A replicação do DNA e a transcrição e amadurecimento dos adenovírus realizam-se no núcleo celular, dentro do qual ocorre um acúmulo de proteínas estruturais “em corpos de inclusão”, característicos em células alveolares durante as pneumonias por adenovírus(36, 37). Os adenovírus encontram-se distribuídos em todo o mundo. Os diferentes sorotipos causam doença em diferentes grupos de idade e a gravidade varia segundo a área geográfica. As infecções são em geral autolimitantes e as características clínicas da doença dependem tanto do hóspede Os vírus como causa de IRA alta e baixa em crianças: características gerais e diagnóstico aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 97 Infecções respiratórias em crianças100 derivada da célula hóspede modificada pela presença de projeções em forma de espículas que são as glicoproteínas hemaglutininas (HA) e a neuroaminidase (NA). O nucleocapsídeo é de simetria helicoidal constituída de 8 fragmentos de RNA monocatenário associados à nucleoproteína e a 3 polimerases. A estrutura segmentada do ácido nucléico explica a labilidade genética e a facilidade com que ocorrem os reagrupamentos genômicos nestes vírus. Os vírus influenza A e B estão distribuídos amplamente e são sazonais em climas temperados. O vírus tipo A foi isolado em 1933 e o tipo B em 1940, ainda que haja evidências de epidemias causadas por este agente há 200 anos (47). A infecção se apresenta em forma de epidemias explosivas e com uma disseminação rápida do vírus em uma região geográfica. A causa fundamental da ocorrência das epidemias de influenza é a contínua aparição de novas cepas antagonicamente diferentes, derivadas de cepas anteriores, que desconhecem a imunidade dos indivíduos e causam doença em pessoas de todas as idades. Estas variações antigênicas são mais freqüentes na influenza A. Durante alguns anos, estas epidemias são causadas predominantemente por um tipo de vírus, mas é freqüente que circule mais de um tipo, seja de forma simultânea ou em seqüência. O vírus da influenza apresenta dois padrões de disseminação diferenciáveis. Um representado por uma mudança antigênica maior (antigenic shift) que ocorre quando aparece um subtipo antigênico novo ou que não tenha circulado por muitos anos, induz pandemias por influenza A a intervalos irregulares e imprevisíveis. Calcula-se que em 1918 morreram aproximadamente 20 milhões de pessoas em todo o mundo, por causa de infecção por um vírus tipo A que se acredita ter sido o subtipo H1n1. As pandemias melhor documentadas aconteceram em 1918, 1957, 1968 e 1977. O outro padrão de disseminação é devido a uma tendência ou variação antigênica menor (antigenic drift), com mudanças relativamente menores e freqüentes (a cada ano ou a cada pouco anos) em um subtipo de influenza. A evolução dos vírus de influenza não é simples e previsível como se acreditava a princípio; atualmente considera-se que uma “nova” cepa não é, necessariamente, a que causa uma pandemia; já se comprovou, por exemplo, que a cepa A/H1N1 que apareceu em 1977, era geneticamente idêntica a uma que circulou em 1950 (3). Os vírus influenza A e B podem causar doença respiratória alta e baixa como traqueobronquite ou pneumonia. Muitas vezes a infecção é subclínica ou apresenta-se com sintomas leves. O vírus, que se dissemina de pessoa a pessoa, tem um período de incubação de um a quatro dias. A infecção por influenza C está associada a infecções subclínicas ou resfriados comuns moderados; não causam epidemias e a mortalidade é infreqüente (47). O diagnóstico do vírus influenza pode ser realizado por inoculações de secreções nasofaríngeas em culturas primárias de células de rim de diversas espécies, ou de pulmão de embriões de galinha, ou ainda em ovos embrionados. Demonstrou-se que o emprego de enzimas proteolíticas, habitualmente de tripsina, pode aumentar a replicação em linhagens contínuas de células como a MDCK (48). Quarenta e oito horas depois de inoculadas as células, é possível detectar a presença aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 100 101 do vírus por hemadsorção com eritrócitos de cobaias (45). Se esta for negativa, o procedimento deve ser repetido 2 vezes por semana. Se o resultado for positivo ou se for observada a ação citopática, a identificação deve ser realizada por IF, com anticorpos específicos. Também pode-se realizar hemaglutinação no sobrenadante. A detecção do antígeno em células epiteliais por IF é usada há muitos anos, e atualmente é um método empregado comumente (33, 49). A técnica de TR-FIA também vem sendo utilizada com êxito há alguns anos (50). A técnica de PCR tem sido utilizada para a identificação do vírus de influenza em amostras clínicas (51), assim como para diferenciação dos diferentes tipos do vírus (52). O diagnóstico sorológico por fixação de complemento ou por inibição da hemaglutinação é útil quando se tem soros pareados, já que a infecção aguda está acompanhada de um aumento importante do título de anticorpos séricos. VII. RINOVÍRUS Os rinovírus pertencem à família Picornaviridae. Caracterizam-se por sua susceptibilidade aos ácidos. São conhecidos até o momento 100 imunotipos (53). Têm de 20 a 27nm e contêm quatro proteínas estruturais que formam um capsídeo sem invólucro de simetria icosaédrica. A síntese e maturação do vírus ocorrem no citoplasma. Constituem a principal causa conhecida do resfriado comum. Infectam somente a seres humanos e primatas superiores e crescem em culturas celulares derivadas destas espécies. A temperatura ótima de replicação é de 33 a 35º C, a temperatura que se encontra no nariz e nas vias respiratórias superiores. Os rinovírus têm distribuição mundial e tendem a ser epidêmicos no outono e na primavera. Os diferentes tipos antigênicos circulam ao acaso. Os sorotipos atuais são substituídos lentamente por diferentes tipos antigênicos. As infecções começam na primeira infância e continuam durante toda a vida. As taxas de infecção variam entre uma e duas infecções por pessoa por ano em crianças menores de 1 ano, a 0,7 infecções em adultos. A disseminação ocorre por meio de secreções de mão para mão, ou por intermédio de aerossóis (54). A duração média da doença que habitualmente é leve, é de sete dias. É pouco freqüente que se solicite um diagnóstico de rinovírus, mas quando é necessário o diagnóstico é feito fundamentalmente por isolamento em células de pulmão embrionário humano (WI-38, MRC5) e em células HeLa. O efeito citopático é característico e aparece entre os dois e os seis dias. A identificação estrita é realizada por demonstração da labilidade aos ácidos (em um pH de 2,9) e por neutralização com anticorpos específicos (realizada em muito poucos laboratórios e raramente se faz necessária). A detecção do genoma viral com técnicas de hibridação de ácidos nucléicos e PCR está sendo atualmente utilizada para estes vírus, nos quais a detecção de antígenos não é possível devido à multiplicidade de sorotipos (55, 3). Os vírus como causa de IRA alta e baixa em crianças: características gerais e diagnóstico aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 101 Infecções respiratórias em crianças102 VIII. CORONAVÍRUS Os coronavírus pertencem à família Coronaviridae, gênero coronavírus. São partículas pleomórficas de 80 a 150 nm, com projeções superficiais em forma de pétala que lhes dão o aspecto de uma coroa. São vírus RNA e todos se desenvolvem de forma exclusiva no citoplasma das células infectadas. Os coronavírus causam resfriados em crianças e adultos. Observou-se que as distintas cepas causam doenças com características semelhantes. O período de incubação é mais prolongado e sua duração mais breve que no caso dos rinovírus, mas os sintomas são similares. Com pouca freqüência causam uma doença respiratória baixa mais séria. Estes vírus encontram-se distribuídos mundialmente, e são mais freqüentes no inverno e na primavera. Podem chegar a constituir 35% do total das infecções respiratórias virais das vias aérea superiores em épocas de alta. A reinfecção é comum. A infecção pode ocorrer em qualquer idade, se bem que é mais freqüente nas crianças. Atualmente pode-se aplicar métodos de detecção de antígenos do vírus por imunofluorescência ou ELISA (56). A recuperação do vírus de amostras clínicas é difícil. A cultura é realizada especialmente em tecidos animais. Há algumas cepas que se adaptaram a crescer em culturas de células fibroblásticas diplóides humanas (56). A forma de diagnóstico mais utilizada até o momento tem sido o aumento de quatro vezes ou mais do título de anticorpos em amostras pareadas, especialmente por fixação de complemento (57). IX. VÍRUS ECHO E COXSACKIE Ambos os vírus pertencem ao gênero enterovírus, família Picornaviridae. Compartilham muitas das características morfológicas, estruturais e físico-químicas dos rinovírus. Possuem um capsídeo icosaédrico nu de 20 a 30 nm, com genoma RNA não segmentado. Têm distintas quantidades de sorotipos: 34 no caso dos ECHO; 24 nos Coxsackie A e 6 sorotipos nos Coxsackie B. Todos podem causar doença febril com sintomas respiratórios, e mais de 90% das infecções causadas por este grupo é assintomático. Uma vez infectado o hóspede, permanecem presentes no trato respiratório por uma a duas semanas. Ambos os gêneros, com sua grande variedade de sorotipos, apresentam problemas para o diagnóstico de laboratório. O fato de crescerem muito lentamente em culturas celulares faz com que sua identificação seja complexa. Em termos gerais, não existem até o momento métodos rápidos acessíveis para detectar os antígenos de todos estes vírus e a sorologia é em geral difícil e custosa (58), motivo pelo qual o diagnóstico destes agentes nas infecções respiratórias agudas não é feito de rotina. aiepi1.P 3/20/03 2:05 PM Page 102 105Os vírus como causa de IRA alta e baixa em crianças: características gerais e diagnóstico 34. Hierholzer JC, Wigand R, Anderson LJ, Adrian T, Gold JW. Adenoviruses from patients with AIDS: a plethora of serotypes and a description of 5 new serotypes of subgenus D (types 43-37). J Infect Dis 1988; 158:804-13. 35. Rowe, Huebner WPRJ, Gillmore LK. Parrot RH, Ward TG. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proc Soc Exp Biol Med 1953; 84:570. 36. Hierholzer JC. Adenovirus. 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