Biologia Molecular, Resumos de Biomedicina

Baixe Biologia Molecular e outras Resumos em PDF para Biomedicina, somente na Docsity! UMIVERDIDADE DE SAO PAULO FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICAS DEPARTAMENTO DE ANALISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS LABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNÓSTICO Apostila de noções de Biologia molecular Prof. Dr. Mario H. Hirata Profa. Dra Rosário D. C., Hirata 1999 ÍNDICE Tópico Página Aula número 1: • Introdução 2 Estrutura do DNA e RNA 2 Replicação, transcrição e tradução 4 Organização do genoma de eucariotos, procariotos e viral 7 Enzimas de restrição e suas aplicações 10 Aula número 2: • Extração do DNA genômico 13 Aula número 3: • Princípios de eletroforese 19 Fatores que influenciam na eletroforese 20 Tipos de suporte 22 Tipos de eletroforese 22 Aplicações da eletroforese nas técnicas moleculares 23 Aula número 4: • Reação de polimerização em cadeia (PCR) 28 Princípios da reação de PCR 28 Protocolo geral para PCR 31 Fatores que influenciam na PCR 31 Escolha de iniciadores para PCR 35 Aula número 5: • PCR no Diagnóstico das Doenças genéticas 39 Polimorfismo e mutações 39 Diagnóstico de alguns polimorfismos por PCR 41 Polimorfismo de apolipoproteína 42 Polimorfismo de receptores da LDL 44 Aula número 6: • PCR no diagnóstico de Doenças infecto-contagiosas 46 Meningites bacterianas 47 Tuberculose 50 Infecção pelo virus da Hepatite C 59 Infecção pelo virus HIV 64 Aula número 7: • PCR e RFLP na identificação de indivíduos 68 proteina DNA-específica e várias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, então, de forma independente e separada. A replicação pode ter início em vários sítios, mas cada origem de replicação é utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha é sintetizada pela ação catalizadora da DNA polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotídeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa polimerase sintetiza DNA na direção de 5' para 3', a síntese de uma das cadeias complementares é realizada de forma contínua enquanto que a outra é sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia discontínua são ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e manutenção da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da dupla fita, assim como no reconhecimento dos sítios de iniciação. As DNA polimerases possuem também, além da função de sintetizar polinucleotídeos, atividade exonucleásica ou "a correção de leitura" na qual os nucleotídeos incorretamente incorporados são removidos. Essa propriedade é fundamental para a manutenção a integridade da sequência original. Figura 2. Representação da molécula de DNA durante a replicação: as duas cadeias precursoras são separadas e as cadeias complementares que são sintetizadas. Transcrição A síntese protéica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA. Sabemos que o DNA está localizado no cromossoma do núcleo da célula e a síntese protéica ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informações genéticas contidas na sequência nucleotídica do DNA têm que ser transferidas para uma molécula intermediária que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro (mRNA), e que ordena, então, a síntese da proteina. O processo de síntese de mRNA é conhecido por transcrição e o tamanho da molécula de mRNA é definido pela sequência de aminoácidos que o ácido nucleico codifica. Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de mRNA para cada gene. A indicação de qual fita do DNA deve ser transcrita é orientada por uma sequência específica denominada promotor, localizada antes (“upstream”) da sequência a ser transcrita, que é reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosídeo à extremidade 3’ da cadeia de RNA em crescimento, a polimerização ocorre na direção 5’ - 3’. Isto significa que cada molécula de mRNA será identica à sequência nucleotídica da fita de DNA que não é transcrita. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (RNA ribossômico, rRNA) no citoplasma, onde ocorre a síntese protéica. O material genético de certos virus (retrovirus) é o RNA e a informação genética segue, portanto, a direção reversa (de RNA para DNA). Este processo é conhecido por transcrição reversa, na qual a sintese de DNA é dirigida pelo RNA e a enzima responsável é denominada transcriptase reversa. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos retrovírus. Tradução A relação entre a sequência de nucleotídeos do DNA e a sequência de aminoácidos da proteina correspondente é denominada código genético. Esse código é universal e é encontrado em todos os organismos vivos. O código genético é lido em grupos de três nucleotídeos, cada um codificando um aminoácido (Tabela 1). Cada sequência de trinucleotídeo é denominada codon e a sequência de condons que codifica um polipeptídeo específico é denominada cistron. Tabela 1. O código genético 1a.base(5’) 2a. base 3a.base (3’) U C A G U Phe Ser Tir Cis U Phe Ser Tir Cis C Leu Ser Terminação Terminação A Leu Ser Terminação Trip G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Glu Arg A Leu Pro Glu Arg G A Isoleu Treo Asp Ser U Isoleu Treo Asp Ser C Isoleu Treo Lis Arg A Met* Treo Lis Arg G G Val Ala AcAsp Gli U Val Ala AcAsp Gli C Val Ala AcGlu Gli A Val Ala AcGlu Gli G * codon de iniciação O processo de decodificação pelo qual a informação genética presente na molécula de mRNA dirige a síntese proteica é denominado tradução. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de transferência ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotídeos em comprimento e é de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro da molécula, adquire a forma de uma folha de trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotídeo de sequência variável forma o anti-codon que pode parear com um codon da molécula de mRNA. Na outra extremidade da molécula de tRNA está uma sequência para ligação a um aminoácido específico. Portanto, um codon particular no mRNA é relacionado através de um tRNA a um dado aminoácido. Na tradução, o ribossoma liga-se primeiramente a um sítio específico na molécula de mRNA (codon de iniciação, ATG) que ajusta a fase de leitura ("reading frame"). O ribossoma, então, se movimenta ao longo da molécula de mRNA, traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para adicionar aminoácios ao final da cadeia polipeptídica em alongamento. A tradução é finalizada quando o ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de terminação ("stop codon"). A direção da leitura é de 5’-3’, sendo que a sequência de nucleotídeos da fita de DNA corresponde à sequência de aminoácidos da proteina traduzida na direção do N-terminal para o C-terminal. Em princípio as sequências de bases nos ácidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer fase de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificação se inicia. Para uma dada sequência UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as três fases de leitura possíveis são : UUA GCA AAG CUG CGA A UAG CAA AGC UGC GAA U AGC AAA GCU GCG AAU G Entretanto, o código genético não se sobrepõe, pois a fase de leitura é ditada pelas sequências de iniciação e de terminação da tradução presentes na molécula de mRNA. A fase de leitura pode ser alterada por mutações que removem ou inserem bases na sequência nucleotídica. Esse tipo de alteração é conhecido como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da função da proteina produzida. • Organização do genoma de eucariotos, procariotos e viral Estrutura Gênica Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequência de nucleotídeos na qual estão dispostos muitos genes. O gene é uma unidade de herança constituida por uma sequência nucleotídeos que carrega as informações necessárias para a síntese de um dado polipeptídeo. O gene é uma entidade estável mas pode sofrer mutações, sendo que a nova forma do gene é herdada de modo estável, exatamente como a forma que lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas, denominadas alelos, que determinam a expressão de alguma característica particular. Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genômico não é totalmente transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplóide (gamético) humano compreende 3 x 106 kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento, deveria haver 1 milhão de genes, mas somente 3000 locos de doença foram identificados. Mesmo considerando todos os outros genes que conferem as características normais como altura e inteligência, uma grande porção do DNA genômico não tem função definida. Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem funções importantes, incluindo o controle de ação gênica. Genes que são responsáveis pela síntese de enzimas específicas ou peptídeos são denominados de genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos genes estruturais. Controle da expressão gênica Nas células existem mecanismos moleculares que controlam o número e a quantidade das proteinas produzidas. As diferenças na síntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as taxas em que as moléculas de mRNA são transcritas a partir do DNA (controle transcricional) ou traduzidas (controle traducional) Processamento pós-transcricional do mRNA A transcrição e a tradução nos procariotos são processos concomitantes mas nos eucariotos são processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos eucariotos a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma. Durante a passagem do núcleo para o citoplasma, o mRNA transcrito (denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro. Nos procariotos, a sequência de nucleotídeos do gene é colinear com a sequência de aminoácidos de uma dada proteína, entretanto, nos eucariotos a sequência codificante é geralmente interrompida por sequências adicionais. A maioria dos genes dos eucariotos são compostos por regiões codificadoras denominadas exons e regiões não-codificadoras denominadas introns. Estes introns são sequências posteriormente removidas durante o processamento do transcrito primário. Esse processo é denominado processamento do RNA ou “RNA splicing”. Após a remoção dos introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequência AAUAAA extremidade 3’ do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucarióticos possuem 100 a 200 resíduos de adeninas ligadas à extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poli-A polimerase. Antes que ocorra a remoção dos introns, o mRNA sofre a adição de resíduos de 7-metil- guanosina (Caps) na extremidade 5’, denominada metilação Cap. Esse processamento sofrido pelo mRNA torna a molécula mais estável e facilita o seu deslocamento para o citoplasma. Entretanto, mutações que ocorrem nas regiões de junção dos exons podem modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA maduro que codifica para uma proteína diferente da original. Alguns genes complexos tem moléculas de mRNA muito grandes, que são processadas de diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que são traduzidos em polipeptídeos diferentes. Esse processo é denominado processamento alternativo (“alternative splicing”) e ocorre no mesmo tecido mas em diferentes estágios de desenvolvimento e diferenciação e pode também ocorrer em diferentes tecidos. Estrutura gênica dos procariotos Existem regiões específicas no DNA, denominadas promotores que identificam o sítio de início da transcrição do RNA (região na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição). Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metabólica são adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequências regulatórias. Este conjunto é denominado operon, sendo que a sequência que regula a expressão desses genes é denominada operador. O operador encontra-se antes (“upstream”) da sequência do promotor, nas posições de -35 a -10 antes do início da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulação destes operons obedece a condições nutricionais ou ambientais. O estímulo da expressão de uma enzima em resposta à presença de um substrato particular é denominada indução. A lactose, por exemplo, pode servir como fonte de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato depende da hidrólise de seus componentes, glicose e galactose, pela enzima β-galactosidase. A presença de lactose (indutor) induz a síntese de β-galactosidase por ativação do operon da lactose (operon lac), aumentando a taxa de ligação da RNA polimerase ao DNA e a taxa de síntese do mRNA da β-galactosidase. Na ausência do indutor o operon é reprimido pela ação do repressor. O repressor liga-se a uma sequência especifica no operador, bloqueando a ligação da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a síntese de mRNA que codifica para a β galactosidase. Estrutura gênica dos eucariotos Os promotores dos eucariotos são elementos que sinalizam o sítio onde a transcrição deve iniciar-se e, possivelmente, controlam o nível de expressão do gene associado. Geralmente estão localizados cerca de 30 bases “upstream” do codon de iniciação (ATG) e ompreendemsêquencias denominadas “boxes” ou “motifs”. As mais frequentes são as TATA, CAT e CG “boxes. Além dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequências regulatórias adicionais conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, “upstream” ou “downstream”) e que potenciam a taxa de transcrição. É importante salientar que estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua Aula número 2 Extração de DNA genômico Profa.Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Marcos de Oliveira Machado • Introdução O potencial de aplicações das técnicas de DNA recombinante em laboratórios de Bioquímica Clínica estão se tornando altamente evidentes, especialmente para a análise do diagnóstico das várias doenças genéticas e de outras mais. Correntemente, as análises de DNA para o diagnóstico estão disponíveis somente para algumas desordens genéticas, mas o campo de estudo está rapidamente se expandindo e novas análises estão sendo desenvolvidas. A maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos humanos. Tradicionalmente essas técnicas de extração consomem muito tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. A maioria dos métodos populares para esse fim, envolve digestão com proteinase K, que leva aproximadamente dois dias, e requer um grande volume de sangue (10-15 ml), ou utilizam solventes orgânicos como o fenol, clorofórmio e álcool isoamílico, os quais são altamente tóxicos. Embora esses métodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma grande variedade de amostras, eles requerem muitos passos e podem incluir a transferência dos extratos de DNA para recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vários filtros comerciais ou colunas. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferência cruzadas de amostras ou a introdução de contaminantes. Tais técnicas não são bem apropriadas para o uso na rotina dos laboratórios clínicos. Portanto, um método simples, rápido e econômico é necessário para a introdução das análises de DNA nos laboratórios de Bioquímica Clínica. Os estudos de ligação genética utilizando a técnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP), a reação em cadeia da polimerase (PCR), a técnica de transferência de DNA (“”Southern blot””), e outras, necessitam que o DNA extraído esteja em boas condições de uso; ou esteja livre de contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reação. O uso da técnica de precipitação salina para a extração de DNA utilizando como detergente o Triton X-100, evita o uso dos perigosos solventes orgânicos e o alto custo e demorada digestão da proteinase K. Esta técnica envolve a desidratação e precipitação das proteínas celulares com solução de cloreto de sódio concentrada. O DNA extraído fica livre de RNA, de proteínas e da degradação de enzimas. A quantidade e a qualidade do DNA extraído é muito boa comparada com as outras técnicas de extração. O DNA é apropiado para as técnicas de biologia molecular, como as que utilizam o PCR e a digestão com enzimas de restrição. • Preparação e análise de ácidos nucleicos Os métodos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos consistem de três etapas: (1) lise das células e solubilização do DNA ou RNA; (2) médodo enzimático ou químico para remover as proteínas contaminantes e outras macromoléculas; e (3) precipitação alcoólica para isolamento do DNA. Os protocolos básicos geralmente são aplicáveis a um ampla variedade de materiais. 1. Isolamento de DNA genômico de tecidos e células: O método básico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o detergente iônico SDS, extração fenólica das proteinas e precipitação etanólica do DNA. Este método é útil para preparação de DNA genômico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mínimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA genômico produzido é adequado para amplificação por PCR ou para a disgestão com enzimas de restrição e análise de transferência de DNA. Uma quantidade substancial de RNA acompanha o DNA genômico, o que dificulta a quantificação por espectroscopia no UV. Algumas amostras de DNA não amplificam bem por PCR ou não são completamente digeridas com enzimas de restricão e devem, portanto, ser reextraidas. Outro método compreende a solubilização dos tecidos ou células com SDS, que inativa as DNAses endógenas. A proteinase K é usada para digerir as proteinas celulares, seguida de digestão com Rnase para remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princípio anterior. Este método é adequado para extrair DNA genômico para análise de DNA por Southern blot ou construção de bibliotecas genômicas. Porém não é adequado para extrair DNA de tecidos pois não há etapa de ruptura do tecido conectivo.. O protocolo mais adequado à rotina laboratorial para avaliação de polimorfismos e mutações genéticas compreende a lise celular com SDS, remoção das proteinas por precipitação com cloreto de sódio concentrado (“salting-out”) e isolamento do DNA genômico por precipitação etanólica. 2. Isolamento de RNA de células ou de amostras biológicas A maioria dos procedimentos de purificação e concentração de RNA são semelhantes aos utilizados na purificação de DNA, exceto que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para precipitação do RNA. É essencial que toda água usada diretamente ou nos tampões seja tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases. O método mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilização simultanea do tecido ou células e inativação de Rnases endógenas na presença de isotiocianato de guanidina, com subsequente separação do RNA do DNA e das proteínas por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio. Dois outros métodos que não requerem ultracentrifugação podem se utilizados: (1) lise com detergente não-iônico para proporcionar um método rápido para preparação de amostras de RNA citoplasmático e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoção das proteinas pela extração fenólica em pH ácido, seguida de precipitação do RNA. O segundo método é frequentemente utilizado para isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biológicas Outros métodos de isolamento e identificação do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por cromatografia com oligo-dT celulose; (2) separação eletroforética do RNA em gel de agarose contendo formaldeido para detecção e quantificação de espécies específicas de RNA por Northern blotting e hibridização; entre outros. 3. Isolamento de DNA genômico de bactérias As bactérias de uma cultura líquida saturada são lisadas e as proteinas removidas por digestão com proteinase K. Os debris de parede celular, polissacarídeos e as proteinas remanescentes são removidas pela extração fenólica e o DNA genômico é recuperado do sobrenadante resultante pela precipitaçao com etanol. • Purificação e concentração de DNA de soluções aquosas Os procedimentos de isolamento de dsDNA e ssDNA a partir soluções aquosas são úteis quando proteinas ou solutos necessitam ser removidos, ou quando soluções de DNA necessitam ser concentradas. O protocolo básico é apropriado para purificação de DNA a 1 mg/mL a partir de volumes menores que 0,4 ml. 1. Extração fenólica e precipitação etanólica Um dos métodos mais úteis e usados para isolamento e concentração de ácidos nucleicos de soluções aquosas é a extração com fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol. Durante a extração orgânica, as proteinas contaminantes são denaturadas e mantidas na fase orgânica ou na interface entre as fases orgânica e aquosa, enquanto que os ácidos nucleicos permanecem na fase aquosa. O fenol usado nesse protocolo deve ser tamponado para prevenir que os produtos oxidados presentes no fenol danifiquem os ácidos nucleicos. Alcool amílico frequentemente é adicionado à mistura fenol/clorofórmio quando ocorre a formação excessiva de espuma durante a extração. Durante a precipitação com etanol, os sais e outros solutos como os resíduos da extração fenol/ clorofórmio permanecem em solução enquanto os ácidos nucleicos formam um precipitado que pode ser facilmente separado por centrifugação. Na presença de altas concentrações de cátions monovalentes (0,1 a 0,5 M), o etanol induz uma transição estrutural nas moléculas de ácido nucleico promovendo a agregação e precipitação das mesmas. Entretanto, como vários sais e pequenas moléculas orgânicas são solúveis em etanol a 70%, a precipitação etanólica e lavagem do sedimento elimina os sais no DNA. Embora cloreto de sódio, acetado de sódio, e acetato de amonio sejam capazes de induzir a precipitação, é mais difícil remover cloreto de sódio devido a sua baixa solubilidade em etanol a 70%. O sal recomentado para a maioria das aplicações de rotina deste método é o acetato de sódio a 0,3 M (concentração final), que é mais solúvel em etanol que cloreto de sódio a 0,3 M e, portanto, menos facilmente precipitável com a amostra de ácido nucleico. Para amostras contendo dodecil sulfato de sódio (SDS), o sal recomendado é cloreto de sódio 0.2 M, pois o SDS é solúvel em etanol nessas condições. Soluções de DNA diluídas: quando soluções de DNA estão diluidas (< 10 µg/mL) ou quando menos que 1 µg de DNA está presente, deve-se aumentar a proporção de etanol para o volume aquoso (3:1) e aumentar o tempo de precipitação (4 a 16 horas), incubando-se a -20oC (ou em gelo seco). A centrifugação para separação do DNA precipitado deve ser feita a baixa temperatura para assegurar o máximo de recuperação do DNA dessas soluções. Pequenas quantidades de DNA (nanogramas): pode-se utilizar um ácido nucleico carreador, como o tRNA de E. coli, levedura ou fígado bovino, em concentrações de 10 µg/mL. Nessa condição o DNA é coprecipitado com o tRNA. O tRNA não interfere com a maioria das reações enzimáticas, mas será eficientemente fosforilado pela T4 polinucleotídeo quinase e não poderá ser usado se esta enzima for usada em marcações subsequentes. Recuperação de pequenas quantidades de fragmentos curtos de DNA e oligonucleotídeos pode ser aumentada pela adição de cloreto de magnésio a uma concentração inferior a 10 mM antes da adição do etanol. Entretanto, o DNA precipitado de soluções mais concentradas que 10 mM de íons magnésio ou fosfato são dificeis de dissolver e devem ser dulidas antes da precipitação com etanol. Se a amostra de DNA está em baixa concentração em um grande volume, o volume pode ser reduzido pela extração repetida com sec-butanol (2-butanol). Cabe lembrar que apenas a água é removida com essa Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY. • Aula número 3 Princípios de Eletroforese Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata • Introdução Eletroforese é uma técnica de separação que envolve o movimento de partículas com cargas em solução, sob ação de um campo elétrico. Portanto, qualquer partícula ou molécula carregada pode se mover nessas condições, e consequentemente podem ser separadas, desde que tenham diferentes cargas. A separação eletroforética das partículas pode ser realizada em meio líquido(eletroforese livre de Tisellius) ou em um suporte inerte. A carga eletrica aplicada sob a solução é realizada através de eletrodos que são colocadas na solução. Um ion migra através da solução na direção ao eletrodo de carga oposta. Portanto, uma partícula carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo (catodo), enquanto as partículas negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo). • Princípios básicos da eletroforese Terminologia: ânion: partícula carregada negativamente ou íon cátion: partícula carregada positivamente tampão: Uma mistura de substâncias que doam e aceitam proton com a função de manter a concentração do proton (pH) constante ou dentro de um valor próximo. Um tampão pode ser feito com uma mistura de um ácido fraco com o respectivo sal. Ex: ácido acético e acetato de sódio. Condutividade: a propriedade de uma substância conduzir a corrente elétrica. Numa solução iônica, a soma do produto da concentração da carga e a mobilidade da mesma. eletrodos: substâncias em contato com um condutor. A substância estão conectadas a fonte elétrica. Fonte elétrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contínua, que possa ser controlada por um potenciometro, que permite variar a tensão, a corrente, a carga elétrica que se quer aplicar no sistema. Esse equipamento, pode medir a tensão elétrica (em Volts), a corrente elétrica(Amperagem), e a potência elétrica (Watts). eletro-osmose; tendência da solução se mover em relação a uma substâncias estacionária adjacente, quando uma diferença de potencial é aplicada. força iônica: É a soma da concentração de todos ions na solução, medido pelo quadrado de suas cargas. mobilidade: a velocidade de uma partícula ou ion que é dado pela voltagem aplicada. Uma medida relativa de quanto rápido um ions se movimenta em um campo elétrico. Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substância sob certas condições. Geralmente é menor que a mobilidade devido a menor carga, ou resistência do suporte ou meio. poder de resolução: E’ a habilidade de separar substâncias que migram muito próximas. gel: É uma malha de fibras, ou de polímeros que é sólida, mas retém uma grande quantidade de solventes nos poros ou nos canais internos das malhas. • Fatores que influenciam na separação e mobilidade eletroforética A aplicação de um campo elétrico a uma solução que contém partículas carregadas pode separá-los. A separação depende de vários fatores que influenciam e que podem ser resumidas em: Força aplicada nas partículas (voltagem), carga da partícula, pH do meio, condutividade do meio, resistência da matrix, conformação da partícula, força iônica do meio, temperatura, eletroendosmose, etc 1. Força na partícula A força exercida em uma partícula carregada depende do campo elétrico, voltagem ou volts por centímetro, e a carga da partícula, Q. A força sob a partícula carregada é o produto: Feletrica=QV A força elétrica, Feletrica, quando exercida na partícula, causará o seu movimento. No entanto, o movimento da partícula no solvente será também influenciado pela resistência, devido a viscosidade, a resistência, a qual exerce uma força é proporcional a velocidade: Fresistência= fv A constante de proporcionalidade, f é chamada de coeficiente de fricção (medida de resistência de uma partícula oferece quando em movimento em um solvente). 2. Coeficiente de fricção depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da partícula Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais assimétrica a partícula, menor seu movimento através do solvente. O coeficiente de fricção de uma grande partícula tais como proteinas é uma propriedade característica de cada elemento. 3. Mobilidade da partícula Quando um campo elétrico é aplicado em uma partícula carregada, ela inicia a migração. A força eletroforética e a fricçional se opõe uma a outra, e a velocidade dessa aumenta até as forças se igualarem (Feletrico = Fresistencia ). A velocidade, v, que uma particula alcança em um campo elétrico, V, é determinado por duas propriedades das partículas - sua carga e seu coeficiente de fricção. Consequentemente, o valor de v/ V é também uma propriedade característica das partículas e é importante o suficiente para receber o seu próprio nome: mobilidade. 4. Efeito do pH do meio Cada íon possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a solução contém uma substância a qual o pK é próximo do pH do meio, esta substância ocorre em ambas as formas: a carregada e a não carregada. A fração com uma carga será dependente do pK da substância e o pH da solução. Quando o pH é igual ao pK de um ácido fraco, somente 50% das partículas estarão carregadas. Uma unidade de pH abaixo da pKa, 90% das partículas estarão sob a forma carregada. Desde que a carga efetiva de uma substância varia com o pH, a sua mobilidade efetiva também varia com o pH. O pH da solução é escolhido de tal forma, que a partícula a ser separada pela eletroforese, se mantenha em um estado máximo de carga, para sua máxima separação. Os tampões são substâncias iônicas por si, portanto, exercem a função de manterem o pH o mais próximo possível da ideal e fazem parte do processo. 5. Condutividade e movimento dos íons Em qualquer sistema elétrico, a corrente produzida é proporcional a voltagem aplicada; V = resistência X Corrente ou V = corrente___ condutividade Na eletroforese, a corrente é um fluxo de íons(em ambas direções). A condutividade é a soma das concentrações multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um íon com maior mobilidade efetiva carreia uma maior fração da corrente A voltagem, condutividade, e a corrente portanto estão todos relacionados. Se a condutividade está aumentada pelo aumento da concentração salina a corrente se mantém constante, a voltagem deve decrescer. Se decresce a voltagem reduz a força elétrica, Feletrica, nas partículas carregadas, diminuindo o movimento das macromoléculas. O aumento do tempo seria necessário para uma separação, e a resolução diminui devido ao aumento da difusão. Se a condutividade está aumentada numa voltagem fixa, a corrente deve aumentar, portanto aumentando o calor elétrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento é proporcional ao quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distúrbios convectivo nas soluções, a qual distorce o padrão eletroforético e pode também desnaturar as macromoléculas. Desde que o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletério, resultados ótimos podem ocorrer quando se conserva a concentração dos ions e portanto a condutividade em valores moderados. 6. Carga e conformação Como já se discutiu, o que determina a migração eletroforética é a carga da partícula que se quer separar. Muitas vezes, a distribuição das cargas não estão desvinculadas a sua conformação estérica, Composição das bases e temperatura: O comportamento eletroforético do DNA em gel de agarose não é significantemente afetado pela composição das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. Dessa forma, os geis de agarose e a mobilidade eletroforética dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos não muda entre 40C a 300C. Em geral, os geis de agarose são submetidos a corrida em temperatura ambiente. No entanto, em concentrações muito baixas (0,5%) os géis são pouco consistentes, sendo convenientes trabalhar em baixas temperaturas, pois esses géis ganham mais firmeza, da mesma forma os géis de agarose de baixo ponto de fusão(“low melting” agarose). 1.4. Tampões utilizados Existem uma variedade de tampões que podem ser utilizados para separação eletroforética de DNA. Tampões concentração formulação Tris-acetato (TAE) 0,04M Tris acetato 0,01M EDTA 50X 242g tris base 57,1 ml ácido acético 100ml EDTA 0,5M(pH8,0) Tris-fosfato (TPE) 0,08M Tris-fosfato 0,002M EDTA 10X 108 g Tris Base 15,5ml de ac. fosfórico 85% 40ml EDTA 0,5M (pH8,0) Tris-borato (TBE) 0,089M Tris borato 0,089M ac. bórico 0,002M EDTA 5X 54g Tris-base 27,5g ác. bórico 20 ml EDTA 0,5M (pH8,0) 1.5. Tipos de Agarose Muitos tipos de agarose estão disponíveis, o que se recomenda para uso diário é o tipo II, baixa eletroendosmose. O inconveniente desta agarose é que possue contaminantes de polissacárides sulfatados que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases. No entanto, a sua utilização é muito difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de reações com essas enzimas 1.6. Coloração do DNA em gel agarose O método mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose é a coloração por brometo de etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contém um grupo planar, que intercala entre as bases do DNA. A posição fixa do grupo e sua proximidade às bases causa uma ligação do corante com o DNA, que se destaca com um aumento da fluorescência comparada com o corante em solução sob a forma livre. A radiação UV absorvida pelo DNA a 260 nm é transmitida para o corante, ou a irradiação absorvida a 300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito, é emitido a 590nm na região da cor vermelho alaranjada, do espectro visível. O brometo de etídio pode detectar tanto os ácidos nucleicos de simples ou de dupla fita. No entanto, a afinidade do corante pela fita simples é relativamente baixa, e a fluorescência emitida é fraca. Geralmente o brometo de etídio é incorporado no tampão de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse caso devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas está reduzida na presença do corante em aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento é a possibilidade de visualizar o gel durante a separação eletroforética, sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba, simplesmente incidindo a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da coloração posterior basta imergir o gel numa solução de brometo de etídio, no próprio tampão de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descoloração normalmente é dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA é muito reduzida, a pouca fluorescência do brometo de etídio pode interferir na visuallização da banda de DNA. Neste caso recomenda-se imergir o gel em uma solução de sulfato de magnésio a 1mM por uma hora, a temperatura ambiente 1.7. Documentação: O gel de agarose é facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia instantânea ou sistema automatizado de captura de imagem. O filme mais sensível para essa finalidade é fornecida pela Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000. Sob a luz UV de no mínimo 2500uW/cm 2 e uma boa máquina , utilizando filtro laranja, expõe-se por alguns segundos. Recomenda-se para a máquina Polaroid modelo DS 34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das bandas e do tamanho do gel. Para padronização tente vários tempos de exposição com várias aberturas. 2. Gel de poliacrilamida O gel de poliacrilamida é um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separação e caracterização de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem dificudade por geis de agarose. Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de polimerização da acrilamida, que é o monômero, com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza a reação de "cross linking" ou reação cruzada, gera o suporte de poliacrilamida. A polimerização ocorre por ligação vinílica, sob ação de catalisadores, o perssulfato de amônia, cuja fonte de radicais livres é o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxigênio é um inibidor da reação. O polímero formado são cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reação cruzada entre elas é dada pela bisacrilamida. O comprimento médio das cadeias é determinado pela concentração relativa da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relação entre a quantidade de acrilamida e bisacrilamida determina as propriedades físicas do gel, que darão subsídios para separação nesse tipo de gel. O gel de poliacrilamida é utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem ser preparados em uma variada concentração (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a separação e identificação. Acrilamida (%) Intervalo de separação (nucleotídeos) 3,5 10-1000 5,0 80-500 8,0 60-400 12,0 40-200 20,0 10-100 Os géis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois necessita de um ambiente isento de oxigêncio para se polimerizar. O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura até 20 a 30cm de largura por 40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura normalmente para DNA utiliza- se 0,75 a 1,5 mm. Literatura recomentada Kaplan, L.A. & Pesce, A.J. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation, 3a. Ed., J.F. Shanahar & J. Roche, eds., 1996, Mosby-Year Book, Inc., St Louis, USA. Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY. • Aula número 4 REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR) Prof. Assoc.Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata • PRINCÍPIOS DA REAÇÃO de pcr A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain reaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende de ions Mg++, e ocorre em 3 etapas: “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado), “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado) e “extension”(extensão ou seja a polimerização propriamente dita) Metodologicamente a técnica de PCR requer três passos (SAIKI et al., 1.988): 1. Desnaturação - Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Este procedimento é chamado “Desnaturação” ou “melting”, e muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse. 2. Anelamento - A polimerase para assumir suas funções, isto é, anexar as bases complementares, transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA já ligado na região previamente escolhida. A solução, então, é demarcar as extremidades do DNA-procurado ou de interesse nas duas longas fitas simples, tornando-as duplas, apenas nesse intervalo. Para isso adicionam-se, à solução, os “primers” ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples, oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que são sintetizados in vitro baseado na sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à seqüência do segmento de DNA de interesse. O conhecimento da seqüência procurada é naturalmente pré-requisito para a síntese dos “primers”. Os “primers” perseguem na reação as regiões, as quais foram escolhidas, para hibridizar-se às seqüências complementares nas duas fitas simples (usualmente 5’). Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridização dos “primers” descrito como “Annealing” (do inglês), deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 60 °C). 3. Extensão - Quando os “primers” encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNA- Polimerase pode assumir sua função. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de DNA de fita dupla (resultado do anelamento do “primer”), incorporando um a um os nucleotídeos correspondentes, isto é, as bases juntamente com as moléculas de açúcar e fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extensão). A DNA-Polimerase não reconhece apenas o bloco de início como também consegue diferenciar as duas extremidades dos “primers” (3’ e 5’). Ela inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a fita simples daí em diante, portanto, sempre na direção do fragmento procurado. Os fragmentos de DNA recém-formados fornecem mais moldes para a montagem de novas fitas nos ciclos subseqüentes, no entanto, com região já determinada, resumindo, temos uma reação em cadeia. Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um formando-se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de tal forma que pode ser definida matematicamente por: N = número de moléculas amplificadas No = número de moléculas iniciais n = número de ciclos de amplificação O modelo teórico considera que a eficiência do processo de amplificação corresponde a 100%, o que não é observado na prática. Experimentalmente, a eficiência da reação está abaixo da ideal e gira entorno de 78% a 97%, dependendo do gene amplificado. Teoricamente após 20 ciclos têm-se cerca de um milhão; após 30 ciclos, cerca de um bilhão de cópias do fragmento de DNA de interesse. Automação da PCR O procedimento da PCR foi tão aperfeiçoada desde a sua primeira descrição, que na atualidade transcorre de forma totalmente automática. Uma importante condição para isto foi a substituição da DNA- Pode-se adicionar cerca de 50mM de KCl na mistura de reação para facilitar a hibridaçào dos “primer”. O Cloreto de sódio a 50 mM, ou KCl abaixo de 50 mM inibe a atividade da Taq polimerase. O DMSO (dimetilsulfoxido) é util para a reação de amplificação com Klenow fragmento de E. coli DNA polimerase I; 10% de DMSO inibe a atividade da Taq polimerase em 50%, apesar de Chamberlain e cols. o recomendarem para amplificação de sequências multiplas, na mesma reação. A gelatina, a proteína (albumina bovina, 100(g/ml) e o detergente não iônico como o Tween 20(0,05-0,1%) podem ser utilizados para estabilizar as enzimas, mas muitos protocolos tem dispensado a sua utilização. 5. HIbridação dos iniciadores (“Primer Annealing”) A temperatura e tempo requerido para o hibridação de “primer ” depende da composição em bases, do comprimento e da concentração. A temperatura básica aplicável seria de 5°C abaixo da Tm verdadeira dos primers. Devido a Taq DNA polimerase ser ativa abaixo do intervalo de temperaturas, a extensão dos primers ocorrerá em baixas temperaturas, incluindo a etapa de hibridação. O intervalo de ação da atividade enzimática varia na ordem de 2 vezes a magnitude entre 20 a 85°C. A temperatura de “annealing” no intervalo de 55 a 72°C, geralmente dá melhor resultado. Numa concentração típica de primers(0,2µM), o “annealing” só requer poucos segundos. O aumento da temperatura de “annealing” aumenta a discriminação contra os erros de hibridização dos primers “mispriming”, reduzindo a extensão ou polimerização dos nucleotídeos incorretos no final 3’ dos “primers”. Portanto, as temperaturas de “annealing” mais estringentes, especialmante nos primeiros ciclos poderá aumentar a especificidade. Para se obter uma especificidade máxima, no início dos ciclos aumenta-se a temperatura de “annealing” e adiciona-se a Taq polimerase após a primeira etapa de desnaturação e “annealing” do primer. Baixas temperaturas de etapas de “extension” com altas concentrações de dNTPs favorecem os erros de polimerização, ou seja, os nucleotídeos são incorporados erroneamente, motivo pelo qual alguns autores recomendam a utilização de “primers” mais longos e de 2 temperaturas para o PCR. As temperaturas são de 55 a 75°C para “annealing” e “extension” e 94 a 97°C para desnaturação e separação de cadeias. 6. Extensão (ou polimerização) O tempo de polimerização ou “extension” também depende de alguns fatores como a concentração e o comprimento do DNA a ser amplificado. A extensão dos “primers” tradicionalmente é realizada a 72°C, porque esta temperatura é próxima do ótimo para extensão de “primers” no modelo de DNA do M13. A média de incorporação dos nucleotídeos a 72°C varia de 35 a 100 nucleotídeos por seg-1 dependendo do tampão, pH, concentração salina e natureza do DNA alvo. O tempo de 1 minuto a 72°C é considerado suficiente para a extensão de produtos de até 2kb. No entanto, tempos mais prolongados podem ser úteis em casos de poucos ciclos e se a concentração do substrato for muito baixa e também em ciclos prolongados quando a concentração do produto ultrapassa a concentração da enzima. 7. Tempo e temperatura de desnaturação A maioria das causas de insucesso do PCR é a incompleta desnaturação do DNA a ser amplificado ou do produto de PCR. Uma temperatura típica de desnaturação é 95°C por 30 segundos, ou 97°C por 15 segundos, porém, temperaturas mais altas podem ser apropriadas especialmente para DNA ricos em G+C. Apenas alguns segundos são necessários para desnaturar e separar as cadeias de DNA, porém, um maior tempo é necessário para se atingir a temperatura dentro do tubo de reação. Seria desejável a monitoração da temperatura dentro do tubo de reação utilizando uma sonda térmica de medida exata. A desnaturação incompleta reduz a possibilidade hibridização entre o DNA alvo e os “primers”, diminuindo o rendimento do produto do PCR. Por outro lado, a desnaturação por longo tempo ou alta temperatura leva a perda de atividade da Taq polimerase, que é maior que 2 horas, 40 minutos e 5 minutos nas temperaturas de 92,5; 95 e 97,5°C, respectivamente. 8. Número de ciclos. O número de ciclos dependerá da quantidade de DNA inicial, quando todos os parâmetros estão optimizados. Um erro comum que se comete é um excesso de número de ciclos. Segundo Kary Mullis “Se você tem que ir mais que 40 ciclos para amplificar uma simples cópia de gene, existe alguma coisa seriamente errada com o seu PCR”. Muitos ciclos pode aumentar a quantidade e a complexidade de produtos não específicos. Obviamente, um número muito baixo dará um baixo rendimento do produto desejado. 9. Iniciadores (“Primers”) A concentração dos “primers” entre 0,1 a 0,5 mM são, na maioria das vezes, satisfatórios. Concentrações maiores podem promover “mispriming” e acúmulo de produtos não específicos e podem aumentar a probabilidade de gerar um artefato independente do “template” denominado de “primer- dimer”(dimerização de primer). Produtos não específicos e dimerização de “primer” são por si só substratos para o PCR e competem com o produto desejado pela enzima, dNTPs, e os primers, resultando em baixo rendimento do produto desejado. Algumas das regras gerais para um bom desenho de primers eficientes seriam: de 18 a 28 nucleotídeos em comprimento, tendo cerca de 50 a 60% de G+C na sua composição. A temperatura de “melting” (Tm) dos pares de primers deve ser adequada. Para esse propósito, pode-se usar a regra da prática de 2°C para o A ou T e 4°C para o G ou C. Dependendo da aplicação, o Tm entre 55°C e 80°C são os recomendados. Deve também evitar a complementaridade na porção 3’ do par de "primers", pois isso pode promover a formação de artefatos de dimerização de primers e reduzir a produção do produto desejado. Outra observação é evitar três ou mais C+G na porção 3’ dos primers que pode promover “mispriming” na sequência rica em G+C. Deve-se evitar, quando possível, a presença de sequências palindrômicas dentro dos primers. Se ainda, depois desses cuidados, continuar a falhar, é salutar então tentar outro par de primers. Uma razão menos óbvia para alguns primers falharem é a presença de estrutura secundária no DNA “template”. Neste caso, substituir com 7-deasa-2’deoxiGTP o dGTP e avaliar. O desenho de primers para propósitos especiais também podem ser elaborados tais como a adição de sítios de enzimas de restrição, mutação in vitro, ATG “start codon”, e outros. 10. Efeito Plateau O termo efeito plateau é usado para descrever a atenuação exponencial da taxa de formação de produto de PCR, que pode ocorrer durante a fase tardia do PCR concomitantemente com o acúmulo de 0,3 a 1 pmol do produto desejado. Dependendo das condições da reação e da ciclagem térmica, um ou mais parametros podem ser afetados: 1)utilização dos substratos (dNTP ou “primers”), 2)estabilidade dos reagentes(dNTP ou enzimas), 3)inibição por produto formado(pirofosfato,DNA duplex), 4)competição por reagentes pelos produtos inespecíficos ou dimerização de primers, 5) “reannealing” de produto específico na concentração acima de 10-8 (pode diminuir a eficiência da extensão ou o processamento da Taq DNA polimerase ou causar subdivisão na migração das cadeias e deslocamento de primers) e 6) incompleta desnaturação dos “templates” ou DNAs formados ou separação do produto em alta concentração. Um importante fator que determina o aparecimento do efeito plateau é a presença inicial de baixas concentração de produtos desejado com presença de produtos não específicos resultantes de eventos de “mispriming” que podem continuar a ser amplificados preferencialmente. A optimização do número de ciclos de amplificação é a melhor maneira de evitar a amplificação de produtos indesejáveis. • ESCOLHA DOS INICADORES PARA PCR A. Protocolo básico para desenhar um iniciador (“primer”) 5’para 3’( sense) Regras gerais: Determinar a prioridade da utilização(clonar, PCR, hibridizar, outros) Se for para clonar: analisar a sequência do cDNA estudando as enzimas de restrição do DNA alvo e seguir o protocolo a seguir: 1. Copiar a sequência e região desejada do cDNA de interesse (não mais que 6 aminoácidos ou 18 bp) 2.Adicione no início 6 bases aleatórias 3.Adicione a sequência a enzima de restrição desejada (Hind III, EcoRI, etc) 4. Acrescentar a sequência que codifica o início da síntese de aminoácido(metionina -ATG) 5. Checar a sequência em voz alta e verificar a porcentagem de Base C+G, que não deve ultrapassar 50% Caso o primer for utilizado para outras finalidades como: hibridização, PCR diagnóstico etc, omita as etapas 2, 3, 4. e acrescente mais pares de base para ajustar a relação C+G se necessário(não > 30). Ex 5’ AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3’ GAT ATG CAT ATG AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3’ random NdeI+iniciador B. Protocolo básico para desenhar um iniciador (“primer”) 3’para 5’ (anti-sense) Regras gerais: Determinar a prioridade da utilização Se for para clonagem seguir os mesmos critérios acima para o “sense primer” 1. Copiar a sequencia da região desejada do cDNA de interesse( não mais que 6 aminoácidos ou 18 bp) 2. Adicione a sequência que codifica o “stop codon” no final da sequência(TAG TAA) 3. Adicione a sequênicia da enzima de restrição 4. Adicione 6 bases aleatoriamente(acertar a relação C+G) 5. Faça a complementar dessa sequência 6.Copie a sequencia complementar em direção oposta ou seja do 5’ para o 3’(pois o sintetizador sempre iniciado 5’) 7. Checar a sequência em voz alta, calcular a relação C+G, não deixando ultrapassar 50% (aceite com as base aleatórias acrescidas). 8. Se não usar para clonagem apenas copie a sequencia desejada, faça a complementariedade e copie a sequencia inversa, checando a sequencia em voz alta. Ex. 5’ CGC AAA GCT CAG ATT GGT 3’ 5’CGC AAA GCT CAG ATT GGT TAG TAA AAG CTT AGA AGC STOPSTOPHindIII bases aleatórias 3’ GCG TTT CGA GTC TAA CCA ATC ATT TTA GAA TCT TCG 5’ 5’GCT TCT AAG ATT TTA CTA ACC AAT CTG AGC TTT GCG 3’ Recomenda-se avaliar o primer desenhado em um programa de computador, para avalia-los adequadamente antes de requerer a síntese. Literatura recomendada Chamberlain, J.S. et al 1988. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 16:11141-11156. Ehln T. & Dubeau, L. 1989. Detection of ras point mutations by polymerase chain reaction using mutation-specific,m inosine containing oligonucleotide primers. Biochem Biophy. Res. Commun. 160:441-7. Mullis, K.B. & Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed reaction. Methods Enzymol.155:335-50. Mullis K.B. et al 1986. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-73. Saiki, R.K.& Gelfand, D.H. 1989. Introducing amplitaq DNA polymerase . Amplifications1:4-6. Saiki R.K. et al 1985. Enzymatic amplification of (globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354. serem metabolizadas e incorporadas ao DNA durante a replicação. Contudo, elas são suficientemente diferentes para aumentar a frequência de pareamento errado e, portanto, de mutação. As radiações aumentam a excitabilidade dos átomos presentes no DNA, e isto é a base dos efeitos mutagênicos da luz ultravioleta e da radiação ionizante. Na natureza, os organismos das mesmas espécies usualmente diferem em alguns aspectos quanto a sua aparência. As diferenças são geneticamente determinadas e são denominadas de polimorfismo. Em muitos locos gênicos, dois ou mais alelos podem ocorrer, constituindo o polimorfismo genético. O polimorfismo genético é definido como a ocorrência em uma população de dois ou mais fenótipos alternativos determinados geneticamente devido a diferentes alelos, pelo qual o menos frequênte alelo não pode ser mantido somente por repetidas mutações. Um loco genético é definido como polimórfico se o (s) alelo (s) raro (os) tem uma frequência de pelo menos 0,01 (1%), e como um resultado, heterozigotos para tais alelos ocorrerem com uma frequência de pelo menos 2%. O polimorfismo pode ser observado à nível do indivíduo como um todo (fenótipo), em formas variantes de proteínas e substâncias de grupos sanguíneos (polimorfismo bioquímico), características morfológicas dos cromossomos (polimorfismo cromossomal), ou à nível de diferenças na sequência de nucleotídeos do DNA (polimorfismo de DNA ou genético). Geralmente, o polimorfismo não é perceptível pelo fenótipo. Os métodos laboratoriais são o meio pelo qual ele é detectável. Diferenças individuais nas sequências das bases dos nucleotídeos do DNA podem ser determinadas. Se a diferença na sequência levar a uma mudança no códon, um diferente aminoácido será incorporado no sítiocorrespondente, Isto pode ser demonstrado pela análise do produto do gene. O polimorfismo de uma proteína (produto do gene) pode ser demonstrado por eletroforese em gel quando a forma variante difere de outras pela presença de um aminoácido com carga elétrica diferente. Neste caso, o alelo forma um produto gênico que pode ser distinguido devido sua diferente velocidade de migração em um campo elétrico (eletroforese). O polimorfismo que não leva a uma mudança na carga elétrica não pode ser identificado dessa maneira. À nível molecular, o polimorfismo pode ser identificado pelo uso de enzimas de restrição que reconhecem no DNA determinadas sequências de bases nucleotídicas (sítios), específicas para a sua atividade de clivagem. Cada enzima (obtidas de uma ampla variedade de bactérias) tem em particular um alvo na dupla fita de DNA, geralmente uma sequência específica de 4 a 6 bp. A mudança em uma das bases da sequência determinará a atividade ou não da enzima naquele sítio específico. Dessa forma, pode-se identificar este tipo de polimorfismo, após a atividade dessas enzimas, por eletroforese em gel. • Análise do polimorfismo de DNA por PCR O surgimento de novas técnicas em Biologia Molecular tem alterado significativamente as formas de abordagem dos problemas básicos e aplicados nessa área. O desenvolvimento da técnica de amplificação de segmentos de DNA utilizando a reação de polimerização em cadeia (PCR) abriu enormes perspectivas para a análise de genes, diagnóstico de doenças genéticas, detecção de agentes infecciosos, entre outros exemplos. A análise do polimorfismo de DNA por PCR é realizada a partir de iniciadores adjacentes a uma determinada região polimórfica do DNA, tornando possível amplificar-se um segmento de DNA que pode ser então, analisado de diferentes formas, como por exemplo, por sequênciamento direto do DNA, por clivagem com endonucleases de restrição (RFLP), ou por hibridização com sondas genéticas. A análise do produto de PCR por determinação da sequência de nucleotídeos é a mais informativa em relação aos polimorfismos. Quando já se tem informação sobre a presença de polimorfismo em um determinado loco, em nível da sequência de nucleotídeos, métodos rápidos e simples podem ser utilizados para detecção dos produtos de PCR por técnicas de hibridização com sondas genéticas específicas, usando-se condições em que a diferença de uma única base pode ser detectada. Esse método tem sido aplicado na detecção de mutações em doenças genéticas, como a anemia falciforme, talassemias e fibrose cística, bem como na tipagem de HLA. O polimorfismo de DNA também pode ser detectado diretamente na reação de PCR. Nesse caso, iniciadores contendo a região 3’correspondente à sequência polimórfica são utilizados e somente ocorre a amplificação quando há o pareamento correto das bases na região 3’. A técnica de PCR foi utilizada, pela primeira vez, na amplificação de DNA genômico para a detecção de anemia falciforme. Desde então, várias outra doenças, como a β- Talassemias, distrofia muscular de Duchenne, síndrome de Lesch-Nyham, fenilcetonúria, fibrose cística, doença de Tay-Sachs e doença de Gaucher, tem sido diagnosticada por PCR. Para algumas doenças em que a predisposição genética é bastante alta, tais como doenças cardiovasculares e doenças auto-imunes, o uso da PCR tem sido de grande utilidade. Mutações no gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL) e polimorfismos nos genes da apolipoproteína B e E (Apo B e Apo E) têm sido detectados por PCR e relacionados com o risco de doenças cardiovasculares. Doenças auto-imunes, como a diabete melito insulina-dependente, esclerose múltipla e artrite reumatóide, estão associadas aos alelos específicos dos locos HLA classe II. • Polimorfismo de Apolipoproteínas Apolipoproteína B A apo B ocorre no plasma em duas formas primárias designadas apo B-100 e apoB-48, que possuem massa molecular relativa (Mr) de 513 Kda e 246 kDa, respectivamente. A apo B-100 é uma das maiores proteínas já conhecidas, contendo 4536 resíduos de amino ácidos e 8-10% de carboidratos. Defeitos genéticos da apo B têm sido descritos, como a hiperapoliproteinemia B (hiperapo-B) e a apo B defeituosa familiar, que podem resultar em diminuição da remoção plasmática dos remanescente de VLDL e das LDL. A hiperapo-B consiste em uma alteração do gene da apo B-100, resultado da substituição da arginina, da posição 4019 na sequência primária da molécula de proteína, pelo triptofano. A hiperapo-B é caracterizada pelo aumento de partículas de LDL pequenas e densas, devido a uma superprodução de LDL, secundária ao aumento da síntese de apo B-100 e na remoção plasmática da LDL. Essas alterações metabólicas estão fortemente associadas com a doença coronariana prematura, embora alguns pacientes com hiperapo-B apresentem níveis normais de colesterol e triacilgliceróis no plasma. A apo B Defeituosa Familiar ocorre por substituição do amino ácido arginina (Arg) pela glutamina (Gln) no resíduo 3500. Essa mutação altera a corformação do domínio de ligação da apo B-100 aos receptores da LDL, prejudicando a interação da LDL com esses receptores. Com isso há uma redução na remoção plasmática da lipoproteínas, que se acumula no plasma, levando a hipercolesterolemia moderada ou severa que é importante fator de risco para o desenvolvimento de doenças ateroscleróticas. Recentemente, a clonagem e o sequênciamento do gene da apo B, localizado no braço curto do cromossoma 2 (2p 23-24), tem permitido estudar a variação do gene à nível de DNA. As endonucleases (enzimas de restrição) reconhecem sitios específicos na sequência de nucleotídeos do DNA (sítios de restrição), onde se ligam e cortam, produzindo diversos fragmentos de acordo com o número de sítios para aquela enzima. O polimorfismo ocorre quando as mutações na sequência de DNA criam ou abolem um sítio de restrição. Analisando estes fragmentos de restrição polimórficos, pode-se identificar alelos de um loco genético em particular que estão associados com um fenótipo clínico, caracterizando o polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP). A associação do polimorfismo genético com uma dada doença ou com um fator de risco pode existir por algumas das seguintes razões: o polimorfismo por sí só pode constituir uma mutação funcional; pode não ter um efeito direto, mas estar acoplado a um desequilíbrio através da mutação funcional; ou a associação pode ser devido a outros fatores. Alguns desses RFLP podem estar associados com variações nos níveis plasmáticos de lipídeos e aterosclerose. Diversos RFLP da apo B foram descritos. A mais consistente associação entre os RFLP e os lipídeos plasmáticos envolve o polimorfismo XbaI, localizado na terceira base do códon 2488 do gene da apo B. Uma única mudança na terceira base deste códon, sem alteração na sequência de aminoácidos da apo B, é suficiente para determinar dois tipos de alelos para este tipo de polimorfismo, os quais podem ser detectados pela enzima XbaI: o alelo X+ (presença do sítio de restrição) e o alelo X- (ausência do sítio de restrição); formando assim três genótipos: X-X-; X-X+ e X+X+. Muitos estudos foram feitos relacionando os alelos e/ou genótipos do polimorfismo XbaI com os níveis plasmáticos de colesterol total, colesterol da LDL, apo B e triglicerídeos. Alguns dados revelam que a LDL de indivíduos com o genótipo X-X- possuem maior afinidade pelo receptor da LDL quando comparada com a LDL de indivíduos com o genótipo X+X+. Outros RFLP do gene da apo B, tais como o polimorfismo EcoRI, MspI e Ins/Del, também vem sendo pesquisados com relação a eventuais influências no mecanismo das doenças coronarianas ateroscleróticas e no seus fatores de risco ambientais, como a dieta. Apolipoproteína E A apo E é o principal constituinte protéico das VLDL e possui um papel importante no metabolismo das lipoproteínas. Ela também está presente nos quilomícrons e seus remanescentes, e nas IDL. A sua principal função está na contribuição para a interação das lipoproteínas com os receptores celulares responsáveis pela captação destas lipoproteínas. A função da apo E no desenvolvimento da aterosclerose não está totalmente esclarecida e especialmente o mecanismo de regulação dos níveis de colesterol através desta apolipoproteína ainda é obscuro. Por outro lado, tem se observado que o polimorfismo da apo E influência na concentração de colesterol da LDL em diferentes popula!ões. A estrutura e conformação da apo E em solução, e especialmente sua topografia na superfície das partículas lipoprotêicas, provavelmente influênciam no metabolismo dessas lipoproteínas sob condições normais e patológicas. O catabolismo de partículas ricas em triglicerídeos, através de receptores pelos quais a apo E serve como ligante, podem desta maneira ser modulados pela conformação da apo E, a qual pode influênciar na afinidade pelo receptor ligante. A apo E é o único ligante para o receptor da VLDL em algumas lipoproteínas tais como os quilomícrons e seus remanescentes. Em outras lipoproteínas, incluindo a VLDL e a LDL, a apo E divide a propriedade de ligante-receptor com a apo B-100. Em humanos o gene da apo E está localizado no cromossoma 19 cercado nas proximidades pelos genes da apo C-I e C-II e bastante distante do gene do receptor da LDL. Dois tipos de polimorfismos da apo E tem sido detectados, um à nível de gene e outro à nível de pós-tradução; o primeiro polimorfismo da apo E é devido a presença de três alelos comuns (ε2, ε3 e ε4) presentes em um único loco. A determinação desses alelos pode gerar seis diferentes genótipos, sendo três heterozigóticos (E3/2, E4/2 e E4/3) e três homozigóticos (E2/2), E3/3 e E4/4). O genótipo E3/E3 é o mais comum e está presente em 60% da população. No primeiro tipo de polimorfismo da apo E, o genótipo E2/2 (associado ao fenótipo E2) difere do E3/3 (E3) pela substituição da arginina pela cisteína na posição 158 da sequência de amino ácidos da apo E, enquanto que o genótipo E4/4 (E4) difere do E3/3 por substituição da cisteína-112 pela arginina. Essas diferenças na estrutura primária influenciam na capacidade de ligação da apo E pelo receptor da LDL (B,E), sendo que o fenótipo E2 possui afinidade aproximadamente 100 vezes menor por esse receptor, que o E3. Os indivíduos que apresentam o fenótipo E2 têm níveis plasmáticos das VLDL e de seus remanescentes aumentados, que estão associados com a disbetalipoproteinemia familiar (Hiperlipoproteinemia tipo III) e representam riscos em potencial para o desenvolvimento da aterosclerose. No fenótipo E4 a capacidade de ligação do receptor da LDL, é normal, porém os níveis plasmáticos de colesterol e de LDL estão aumentados. Esse polimorfismo da apo E também pode ser analisado pela técnica da PCR seguido do uso de enzimas de restrição, específicas para estas regiões polimórficas. • Polimorfismo do receptor da LDL Além das apolipoproteínas os receptores celulares das lipoproteínas também estão relacionados com as variações nos níveis séricos lipídicos e lipoprotêicos. Os receptores são estruturas glicoprotêicas que estão agrupados em regiões definidas da membrana celular, onde a lipoproteína se liga por intermédio da apolipoproteína. Eles fazem parte do mecanismo de remoção das lipoproteínas do plasma e fornecimento do colesterol e triacilglicerídeos para as células. Por isso são responsáveis pela manutenção da homeostase dos lipídeos e das lipoproteínas no plasma e nos tecidos e, ao mesmo tempo, protegem as células do acúmulo desses lipídeos, principalmente do colesterol. Uma variedade de células humanas contêm receptores de alta afinidade para a LDL, também denominados receptores B,E. A LDL liga-se a estes receptores por intermédio da apo B-100 presente nas partículas. O receptor da LDL humano é constituído de 839 resíduos de amino ácidos e apresenta cinco domíneos. Mutações no gene do receptor da LDL causa uma doença hereditária do metabolismo lipídico chamada de Hipercolesterolemia Familiar (FH). A deficiência funcional no receptor da LDL na FH resulta no acúmulo de LDL no sangue. O resultado deste alto nível de LDL induz enfim a uma aterosclerose prematura e ao infarto do miocárdio. Alguns anos atrás um grupo de pesquisadores sugeriu que os genes normais do loco do receptor da LDL poderiam contribuir para variação populacional nos níveis séricos de colesterol. Nos meados de 1980, com o advento da tecnologia do DNA, surgiram novas possibilidades para examinar este problema. O gene do receptor humano para a LDL foi clonado e mapeado no cromossoma 19p 13-2. Um amplo espectro de mutações localizadas na parte estrutural do gene do receptor-LDL tem sido analisadas. Vários RFLP foram encontrados no gene do receptor da LDL. Estudando tais polimorfismos detectou-se correlação com os níveis de colesterol total e LDL alterados. O alelo P- (ausência do sítio de restrição PvuII), do polimorfismo PvuII do gene do repector da LDL, foi associado ao aumento dos níveis séricos de colesterol total e da LDL em várias populações européias. Outros mostraram que a frequência do alelo N- do polimorfismo NcoI) foi significantemente maior em pacientes com FH do que nos indivíduos do grupo controle. Também, uma alta frequência do alelo A- do polimrfismo AvaII foi encontrada em pacientes brancos Africanos com FH. A ligação entre o polimorfismo do loco do receptor da LDL e um perfil lipoprotéico aterogênico sugere que uma mutação no gene do receptor da LDL deve ser responsável por este fenótipo. Diante de todos estes dados podemos concluir que o polimorfismo genético das apolipoproteínas B e E, e do receptor da LDL contribuem de alguma forma para a elucidação dos casos em que ocorrem respostas individual e populacional diferentes frente a determinados fatores de risco, como a dieta, para as doenças cardiovasculares. Literatura recomendada PCR no Diagnóstico das Meningites Bacterianas Professora Dra. Elza Masae Mamizuka Jane Atobe A meningite é um conjunto de síndromes cujo denominador comum é a inflamação meníngea (Gomes, 1991). O período de incubação varia de acordo com o agente etiológico (bactérias, vírus, fungos, protozoários, helmintos ou espiroquetídeos), sendo as bactérias causadoras mais frequentes de meningite. As meningites bacterianas constituem um sério problema de saúde pública em todo o mundo. Elas representam um capítulo de importância pelos altos índices de morbi-mortalidade, principalmente em crianças. A meningite bacteriana é a mais notável e comum infecção que ataca o Sistema Nervoso Central (SNC). Dados da literatura relatam que 70% das ocorrências se dão em menores de 5 anos de idade e a taxa de mortalidade chega a 28% (Kilpe et al., 1993). As sequelas variam desde os problemas de comportamento até danos cerebrais irreversíveis. O risco de morte é muito alto, especialmente quando não se realiza um tratamento adequado. Assim sendo, é fundamental que o diagnóstico e tratamento apropriados realizem-se especifica e prontamente (Radstrom et al., 1994). No Brasil, o problema se agrava devido ao baixo nível sócio-econômico da população, e seus determinantes: pobreza, falta de higiene e baixa nutrição que contribuem para a disseminação e implantação da meningite, além do precário sistema de Saúde Pública que dificulta o diagnóstico precoce e o tratamento adequado. Na Grande São Paulo, o coeficiente de incidência das meningites meningocócicas, no ano de 1995, foi de 7,95 casos/100 mil habitantes, com uma letalidade de 20,42% (Dados provisórios do Centro de Vigilância Epidemiológica - CVE). O diagnóstico da meningite meningocócica inicia-se com a suspeita clínica, porém a confirmação é feita pelo isolamento e identificação da Neisseria meningitidis em amostras biológicas como tecido, sangue e líquor, ou pela detecção de diplococos Gram - negativos. A cultura de sangue apresenta-se positiva em, aproximadamente, 50% dos pacientes. A mortalidade dos indivíduos com doença meningocócica é reduzida quando os antibióticos são administrados em casos suspeitos, antes da admissão em hospital. Entretanto, na vigência da antibióticoterapia, a taxa de isolamento do meningococo no sangue ou no líquor é reduzida de 50% para menos de 5% (NI et al., 1992). Atualmente, o método de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido empregado para amplificar e detectar DNA microbiano em amostras clínicas. Além da alta sensibilidade, a vantagem deste método é a detecção de bactérias mortas ou inibidas pelo antibiótico. Como a meningite bacteriana deve ser tratada de imediato, há necessidade de rápida detecção de microrganismos para o diagnóstico clínico. As desvantagens da microscopia direta e dos testes imunológicos para detecção de antígenos, são bem conhecidos no que diz respeito à sensibilidade e especificidade (Gray & Fedorko, 1992). O método mais específico para diagnosticar a meningite bacteriana é através do isolamento do patógeno em cultura, seguida de identificação (necessidade de 12 a 24 horas de incubação). Para o diagnóstico da meningite meningocócica, emprega-se, atualmente, três estratégias de PCR. A primeira emprega o PCR para detectar o DNA de um único patógeno na amostra biológica. Essa estratégia tem sido utilizada para detectar DNA de Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes (Kilpi et al., 1993) e de Haemophilus influenzae (Ketil et al., 1990). O DNA do meningococo pode ser especificamente detectado pela amplificação do gene da hidropteroato sintetase (dhps) . Esse gene foi clonado a partir do DNA isolado de cepas de Neisseria meningitidis sulfonamida sensível e resistente pertencentes aos sorogrupos A, B e C. O sequenciamento desse gene permitiu construir dois iniciadores para a amplificação do gene dhpa por PCR, denominados NM1 e NM2. O produto de amplificação tem 950 bp de tamanho.. Outro gene que pode ser utilizado para detecção de Neisseria meningitidis por PCR é o 1S1106, descrito por Ni, H. et al. (1992). Nesse caso são utilizados iniciadores adjacentes à extremidade 5’ do gene na posição 850 e na extremidade 3’ na posição 1445 do gene, produzindo um fragmento de 596 bp. A segunda estratégia é utilizar duas etapas de amplificação que permitem a detecção de amplo espectro de patógenos (Radstrom et al., 1994). A primeira etapa de amplificação utiliza um par de iniciadores, denominados marcadores universais de eubactérias, correspondente a um gene de uma região conservada no genoma como o gene da subunidade 16S do rRNA. A finalidade desta etapa é de detectar qualquer agente bacteriano na amostra biológica. Na segunda etapa, os produtos da primeira etapa são amplificados utilizando iniciadores específicaos para Neisseria meningitidis,, através da técnica de PCR "semi-nested" ou são hibridizados com sondas de DNA espécie-específicas. Dados da literatura mostram que o método de PCR como teste de triagem permite uma rápida detecção do DNA bacteriano de várias espécies que causam meningite (Greiser et al., 1994). A terceira estratégia é a amplificação por PCR multiplex, empregando-se iniciadores universais para amplificar o gene de qualquer tipo de bactéria gram-negativa (ex. sonda universal COR28), e iniciadores específicos para N. meningitidis (ex., sonda RDR 47D1). Na PCR multiplex , as duas sequências (universais e espécie-específicas), de 370 bp (universal) e 279 bp (N. meningitidis) são amplificadas em uma única etapa de PCR, o que reduz consideravelmente o tempo utilizado na detecção do meningococo. Devido à sua alta sensisibilidade e especificidade, a prova da PCR em líquor é um teste rápido, extremamente útil para a confirmação precoce do diagnóstico da meningite meningocócica e em situações onde a cultura é dificultada devido à prévia terapia antimicrobiana muitas vezes necessária ou imprescindível. Estudos demonstram que cerca de 23% dos casos com diagnóstico clínico de meningite aguda não apresentam confirmação em exames microscópicos ou em culturas (Grey & Fedorko, 1992). Pela gravidade da enfermidade, justificada tanto pela letalidade como pelo grau de sequelas neurológicas, é de suma importância que o diagnóstico etiológico seja determinado o mais rápido possível, orientando, desta maneira, a conduta clínica e terapêutica. Literatura recomendada Gomes, M. C. O. - Como diagnosticar e tratar meningite. Rev. Bras. Med. 48: 9-27, 1991. Greisen, K.; Loftelholz, M.; Purohit, A.; Leong, D. - PCR primers and probes for 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J. CLin. Microbiol. 32: 335-351, 1994. Ketel Van, R. J.; Wever, B.; Alphen Van, L. - Detection of Haemophilus influenzae in cerebrospinal fluids by polymerase chain reaction DNA amplification. J. Med. Microbiol. 33: 271-276, 1990. Kilpi, T.; Antiba, M.; Markku, J. 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Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Profa. Dra. Elza Masae Mamizuka • introdução A infecção por micobactérias, acomete pacientes de qualquer idade, sexo ou grupo étnico e não sendo tratada oportunamente poderá ser fatal ou trazer consigo um alto risco de seqüelas graves, principalmente nos casos em que a terapia seja retardada ou inadequada (VIAMONT, 1.992). Atualmente, com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), o ressurgimento de micobactérias não tuberculosas, tem aumentado dramaticamente, sendo as de maior interesse em saúde pública as pertencentes aos complexos M. avium e M. fortuitum que apresentam distinto significado clínico, tanto no tratamento como no prognóstico dos pacientes acometidos, e principalmente com implicações epidemiológicas diferentes, (KIEHN & EDWARDS, 1.987, GUTHERTZ et al., 1.989). A tuberculose como doença continua a figurar entre as principais enfermidades que afetam a humanidade (BOOM et al., 1.990, BRISSON-NOEL et al., 1.991). Estima-se que aproximadamente 1/3 da população mundial esteja infectada por M. tuberculosis, com incidência anual de 8 milhões de casos novos da doença (KOCHI et al., 1.992). Simultaneamente ao aumento da incidência da tuberculose, também surgiram cepas de M. tuberculosis multi-resistentes às drogas como a rifampicina e isoniazida. Os dados sobre resistência primária ou secundária no Brasil variam de região para região, sendo de 16,5% no estado de São Paulo e de 19,1 % no Rio de Janeiro (CVE/SP, 1995). Sem dúvida, os principais problemas que se enfrentam na tuberculose são: o problema sócio-econômico, diagnóstico clínico-laboratorial adequado e rápido, tratamento e controle profilático da doença (WHITE & GOLD, 1.992; WILLIANS et al., 1.994; WHELEN et al., 1.995; COOKSEY, et al 1.996). Os recentes avanços da biotecnologia vem sendo conhecidos nos países subdesenvolvidos no entanto, ainda são escassos os recursos econômicos e a falta de apoio aos centros de pesquisa tecnológica, especialmente aos pesquisadores que atuam na área de saúde. Entretanto, a técnica de amplificação do DNA pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido aplicada nos vários centros de pesquisa em diagnóstico e indica ser um procedimento simples e rápido, onde os reagentes são estáveis e os equipamentos de baixo custo (CLARRIGDE 1994). Estudos iniciais têm demonstrado que o custo de insumos e recursos humanos para a realização da técnica da PCR e da cultura são semelhantes. Em razão disso, a técnica da PCR deve ser proposta também como tecnologia apropriada até para laboratórios de saúde pública do terceiro mundo. Com o aprimoramento de sondas genéticas não radioativas específicas para detecção de micobatérias com emprego de técnicas eletroforéticas e de hibridização, a PCR provavelmente, representa um instrumento alternativo interessante para o controle da infecção especialmente na detecção precoce da tuberculose e da identificação de cepas bacterianas resistentes aos quimioterápicos (KIRSCHNER et al., 1.993; KOX et al., 1.994; 1.995). Um fator bastante relevante na identificação de micobactérias é a demora no crescimento bacteriano na cultura, além da dificuldade da realização dos testes de sensibilidade às drogas pelos métodos tradicionais. Outro problema é que os métodos tradicionais apresentam baixa sensibilidade e especificidade, além de ter baixa reprodutibilidade. No entanto, o abandono do tratamento propicia o aumento de transmissão da doença e também contribui para o aparecimento de cepas resistentes por seleção de mutantes na população das micobactérias. Considerando as dificuldades encontradas com esses métodos e a gravidade atual da situação da tuberculose a nível mundial, seria muito importante estabelecermos uma metodologia que gere diagnóstico mais rápido com garantia de alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade. A introdução de tal técnica na rotina diagnóstica será de grande utilidade não somente pela abreviação do tempo mas também, pela facilidade de treinamento técnico para a formação de recursos humanos nesta área (HERNANDEZ, 1996). • Diagnóstico Laboratorial da tuberculose • Microscopia Direta A microscopia ou baciloscopia é um método rápido para pesquisar micobactérias, mas requer aproximadamente 104 bactérias/mL de amostra para ser detectado com segurança na maioria das espécies. A especificidade das baciloscopias positivas é alta (84 - 100 %) (DANIEL, 1.990), mas esta porcentagem pode ser consideravelmente reduzida em zonas endêmicas de infecções pelas bactérias do Complexo Mycobacterium avium (MAC). A coloração fluorescente tem melhorado a sensibilidade da microscopia direta, sem superar de forma considerável à obtida com a coloração de Ziehl-Neelsen, que apesar de apresentar especificidade de 99 %, A detecção da presença ou ausência de micobactérias pode ser feita por hibridização de ácidos nucléicos (DRAKE et al., 1.987), sendo a quantidade do DNA presente na amostra, muitas vezes insuficiente para ser detectada. Têm sido feitas pesquisas de novos métodos que permitem a amplificação de seqüências de DNA específicas. Uma vez que o processo de amplificação detecta a presença de micobactérias não viáveis, ou seja não haja necessidade de crescimento in-vitro, a sensibilidade desta técnica pode superar a cultura. A amplificação da seqüência do DNA micobacteriano tem permitido a detecção e identificação rápida destas bactérias em amostras clínicas. O trabalho publicado por ALTAMIRANO et al. (1.992) para o diagnóstico de tuberculose pulmonar, mostra uma sensibilidade e especificidade aumentadas sendo próximas a 100%. SHANKAR et al. (1.991), identificou M. tuberculosis em diferentes tipos de amostras de pacientes com diagnóstico clínico presuntivo de tuberculose. KANEKO et al. (1.990) utilizando a PCR detectou M. tuberculosis no LCR em 84% do pacientes com diagnóstico clínico de meningite tuberculosa. Para a identificação de micobactérias foram elaborados alguns tipos de “primers” para detectar gênero ou espécies de micobactérias (HANCE et al., 1989; TAKEWAKI et al., 1.993). Tudo depende do nível ou sítio em que vão se ligar os “primers” e os genes que se procura, existindo técnicas baseadas na amplificação de seqüências específicas de DNA ou RNA que estão presentes em todas ou em algumas espécies de micobactérias (BÖDDINGHANS et al., 1.990 a ) Existem “primers” que são utilizados para amplificar genes que codificam proteínas conservativas nas diferentes espécies de micobactérias, como as proteínas “heat shock”. Exemplificamos, os genes groEL e phoS, que codificam as proteínas 65 e 38 KDa respectivamente (HANCE et al., 1.989) ou seqüências repetitivas de inserção como as IS6110, IS6116 ou IS986, onde existem seqüências repetitivas de 1 a 20 vezes no cromossomo de membros do Complexo M. tuberculosis (EISENACH et al., 1.990; HERMANS et al., 1.990 a,b ; THIERRY et al., 1.990; SOINI et al., 1.992). Também estão sendo utilizadas seqüências de oligonucleotídeos da subunidade menor do ribosomas 16S (rRNA) para amplificar fragmentos de DNA capazes de hibridizar com sondas genéticas gênero e espécie específicas. Estas zonas são empregadas devido à capacidade de serem altamente conservativas nos diferentes grupos bacterianos (CHEN et al., 1.989). Esta alternativa está sendo utilizada para a identificação a partir de amostras clínicas das diferentes espécies de micobactérias (WOESE et al., 1.987; EDWARDS et al., 1.989; BÖDDINGHANS et al., 1.990b; ROGALL et al., 1.990; BÖTTGER et al., 1.992; KIRSCHNER et al., 1.993a,b; VUORINEN et al., 1.995). Outros autores classificam as reações de amplificação existentes para micobactérias em gerações. As de primeira geração incluem, principalmente, as reações diretas, como a utilização de genes que codifican proteínas como a IS6110. As de segunda geração incluem metodologias mais complicadas que geralmente constam de duas ou mais técnicas: NASBA (nucleic acid sequence based amplification), TMA (transcription - mediated RNA amplification), SDA (Strand, displacent amplification) e em ambos casos podem ser utilizadas seqüências que codificam IS6110 e 16S rRNA, OLA (oligonucleotide ligation assay) (VAN SOOLINGEN et al., 1.991; MENDIOLA et al., 1.992; VANDER ULIET et al., 1.993; KENT et al., 1.995; KLATSER, 1.995). Os parâmetros de sensibilidade da técnica do PCR para identificar Mycobacterium spp. podem ser afetados diretamente pelos métodos de extração do DNA, já que se utilizam métodos de extração em condições extremas (exemplo: pH). Pela natureza química da bactéria muitas vezes perde-se uma considerável quantidade de DNA, e isto é agravado quando se processam amostras com um alto índice de contaminação, onde existe a necessidade de se descontaminá-los e concentrá-los (exemplo: escarros, aspirado ganglionar). Teoricamente, sabe-se que para detectar micobactérias precisa-se de aproximadamente um fentograma de DNA bacteriano (o que equivalente a 1/5 do microrganismo) (PATEL et al., 1.993), embora em amostras clínicas como escarro seja necessário de 100 a 1.000 organismos (HANCE et al., 1989; HERMANS et al., 1.990b). A sensibilidade pode ser recuperada se utilizarmos métodos de extração com digestão enzimática, extração com fenol clorofórmio e precipitação do DNA com etanol. Este procedimento é mais recomendável quando se processam amostras clínicas. Já que as extrações com detergentes iônicos resultam em uma queda da sensibilidade (SHANWAR et al., 1.993). A sensibilidade também pode ser afetada pelo tempo de detecção do produto pós-PCR. O procedimento mais comum é a visualização do produto em gel de agarose corado com brometo de etídio sob luz ultravioleta, tendo sempre um marcador de peso molecular como referência para caracterizar as bandas de DNA observadas. Outro método comumente utilizado é a hibridização com sondas genéticas complementares as regiões internas dos produtos amplificados. Geralmente os sistemas de hibridização são variados, mas em geral, os produtos pós-PCR podem- se ligar a uma matriz ou membrana de nylon ou nitrocelulose (dot-blot ou slot-blot), onde se adicionam as sondas genéticas marcadas com radioisótopos como o 32P, conjugados enzimáticos ligados a fosfatase alcalina, digoxigenina, biotina - avidina (SHANWAR et al., 1.993; WILSON et al., 1.993) ou métodos quimioluminescentes (BRISSON et al., 1.989, 1.991; KUSUNOKI et al., 1.991) e dependendo do sistema de revelação utilizado pode-se melhorar a sensibilidade em relação ao método de coloração com brometo de etídio. Por combinação da hibridização e PCR ou digestão do produto amplificado utilizando enzimas de restrição (RFLP) as micobactérias podem ser identificadas prontamente, seja a nível de gênero ou espécie (PLIKAYTIS et al., 1.992; HAAS et al., 1.993; TAKEWAKI et al., 1.993). Estas aplicações dependem das condições de cada laboratório e de acordo com o tipo de identificação necessário. A sensibilidade pode ainda ser melhorada submetendo-se os produtos pós-PCR a outra amplificação utilizando “primers” que sejam capazes de amplificar um fragmento interno do produto pós-PCR. A este novo processo denomina-se “Nested-PCR” ou segunda amplificação (SHANWAR et al., 1.993; WILSON et al., 1.993). Para uma melhor ilustração dos métodos que estão sendo aplicados na identificação de micobactérias a partir de amostras clínicas, utilizando PCR, seja direto ou ligado a outros sistemas. A tabela 3 apresenta alguns resultados referentes ao tipo de “primer” utilizado (PAO et al., 1.988, 1.990; BRISSON et al., 1989, 1.991; EISENACH et al., 1.990; 1.991; COUISINS et al.,1.992; SHANWAR et al.,1.993; WILSON et al.,1.993; VUORINEN et al., 1.995), onde a sensibilidade varia de 55 a 100 %, mas a especificidade é alta, variando de 95 a 100 %. Tabela 3: Detecção de M. tuberculosis diretamente de amostras clínicas Referência Número de Amostras Primers Sensibilidade Especificidade PAO et al., 1.990 248 65 k prot 100 % 63 % BRISSON, et al., 1.991 514 65 k prot IS6110 80 - 97 % * EISENACH et al.,1.991 162 IS6110 100 % 95 % COUSINS et al., 1.992 177 MPB70 prot 97 % 76 % WILSON et al., 1.993 171 IS6110 75 - 92 % 99 - 100 % SHANWAR et al., 1.993 389 IS6110 55 - 74 % 95 - 98 % VUORINEN, et al., 1.995 243 rRNA 16S + Hibridização 86.2 % 100% * Não avaliado pelo excesso de culturas negativas das amostras PCR-positivas Como podemos verificar existe uma grande variedade de métodos diagnósticos para micobacterioses, e muitos deles apresentam alguns problemas na correlação da sensibilidade e especificidade (BOOM et al., 1.991, MANJUNATH et al.,1.991; BUCK et al., 1.992; WILSON et al., 1.993). Para superar os diferentes inconvenientes apresentados pelas técnicas descritas na literatura,deve-se procurar optimizar as técnicas tornando-as viáveis para aplicação em laboratórios de rotina. A eleição dos “primers” baseada nos trabalhos de ANDREAS et al.(1.991), BÖTTGER (1989, 1.992); KIRSCHNER et al. (1.993)a,b; INDERLIED, et al., 1.993; CARPENTIER et al., 1.995; VUORINEN et al. (1.995) os quais identificam, seqüências específicas de oligonucleotídeos da subunidade menor do ribossoma 16S (rRNA). Os dois primeiros “primers” que serão utilizados (MB1 - MB2) permitem identificar o gênero Mycobacterium. A partir deste produto pós-PCR, poderemos identificar espécies, submetendo este produto a uma segunda amplificação (Nested-PCR) utilizando “primers” para os Complexos: M. tuberculosis e M. avium (esquema 1). Assim, poderemos contar com um método rápido e relevante para a identificação através da amplificação gênica por “PCR” e “Nested-PCR”, utilizando fragmentos de nucleotídeos altamente específicos para o gênero Mycobacterium e espécies de micobactérias de importância na medicina humana. Literatura recomendada BOOM, R., SOL, C.J., SALIMANS, M., JANSEN P.M., WERTHEIM-VAN DILLEN, J. VAN DER NOORDAS. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol., Washington, v.28, p. 495-503, 1991. BRASIL, Ministéro da Saúde. MS/FNS/CRPHF/PNCT. Reunião de avaliação operacional e epidemiológica do PNCT, na decáda de 80 - 90. Brasília, p.15-27, 1992. BRISSON-NOEL, A., AZNAR, C., CHUREAU, C., NGUYEN, S., PIERRE, C., BARTOLI, M., BONETE, R., PAILOUX, G., GICQUEL, B., GARRIGUE G. Diagnosis of tuberculosis by DNA amplification in clinical practice evaluation. Lancet, London, v.338, p.364-366, 1991. CLARRIDGE, J.E., SHAWAR, R.M., SHINNICK, T.M., PLIKAYTIS, B.B. 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Vale a pena salientar, que a exposição a uma quantidade relativamente pequena de sangue ou de outros fluídos biológicos pode tornar-se um fator significante de risco para HCV nos casos em que os níveis de vírus circulantes são elevados. O fato de ser uma doença transmissível, somado à alta taxa de cronificação com o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular, torna a hepatite C uma doença de importância tanto social quanto médica. A presença de anticorpos anti-HCV em pacientes infectados com o vírus C e a clonagem de vários segmentos do genoma viral, por exemplo 5-1-1, c100-3, c-33c, c-22-3 e c-200, levaram ao desenvolvimento de ensaios imunológicos, correntemente aprovados para a triagem do sangue dos doadores, possibilitando um grande avanço na descoberta do controle da infecção por HCV, evitando uma disseminação desenfreada da doença. O primeiro teste imunológico a ser utilizado, foi um imunoensaio enzimático de primeira geração (EIA) contendo um antígeno recombinante, C 100-3, proveniente da região não estrutural do vírus. A alta freqüência de resultados falso-positivo e falso-negativo (ambos acima de 20%), particularmente quando usado para triar populações de baixo risco, tais como, doadores de sangue, levou a necessidade de se desenvolver novos ensaios. Atualmente, os imunoensaios consistem da detecção de anticorpos contra vários antígenos recombinantes HCV-específicos fixados sob uma fase sólida, denominados testes de ELISA de segunda e terceira geração. Nos testes de segunda geração, os antígenos utilizados são: C100-3; NS4; C33c (NS3) e C22-3 (core). Já os de terceira geração utilizam os antígenos: NS3; NS4; NS5/5N1S (core). Esses antígenos tem sido também empregados em ensaios denominados de RIBA (Radio imunoblot assay - Ortho Diagnosis, Raritan, N.J., USA) para confirmação da triagem de resultados anti-HCV. O RIBA consiste de uma fita de nitrocelulose contendo proteínas recombinantes indíviduais associadas com a proteína Superoxido Dismutase (SOD), com as quais os anticorpos anti-HCV presentes no soro podem reagir. Nesse ensaio, é introduzido um controle com a proteína SOD sozinha, para detectar auto-anticorpos anti-SOD, que poderiam resultar em teste falso-positivo. Usando esses ensaios atuais de ELISA, a sensibilidade para a detecção dos anticorpos anti-HCV é de cerca de 94% à 100% e a especificidade é maior que 97%. Entre as possíveis causas de resultados falso-negativos com os ensaios correntes é a heterogeneidade viral. Os testes são produzidos a partir de sequências de genótipos predominantes de HCV (tipo 1a), cujos antígenos não reagem com anticorpos de pacientes infectados com genótipos menos comuns. Já condições associadas com resultados sorológicos falso-positivo incluem hipergamaglobulenemia e desordens do tecido conjutivo. Outras limitações constadadas com uso dos ensaios imunológicos são as relacionadas com o perfil de soroconversão. Normalmente a soro-conversão do anti-HCV é tardia, ou seja, ocorre após o início dos sintomas clínicos da doença ou a elevação das transaminases (ALT e AST), podendo então o anticorpo anti- HCV ser detectado entre a oitava e décima semana após o contato com o vírus. Já no caso dos pacientes imunossuprimidos, este período torna-se mais significativamente prolongado, uma vez que, o tempo de soro- conversão e a evolução da resposta imune são manifestados tardiamente. Outro aspecto, é o fato de que os ensaios de anticorpos podem promover evidências de exposição ao HCV porém, são incapazes de diferenciar entre uma infecção presente ou passada. Pacientes na fase inicial da soro-conversão apresentam resultados inconclusivos pelos ensaios imunológicos. Claramente, pacientes infectados recentemente apresentam soro com reação fraca (indeterminada) que, ocasionalmente, torna-se positivo, com o passar do tempo se obtidas outras amostras em coletas posteriores. Comumente, a soro conversão para o anti-HCV é completamente tardia após o início da ictéricia ou elevação dos níveis das transaminases e o anticorpo pode não ser detectado até 8 a 12 semanas após a infecção. Neste estágio, a reação EIA é fraca e deve ser confirmada através do RIBA ou Western blot. As falhas metodológicas observadas nos ensaios imunológicos para o diagnóstico da hepatite C, definiu a necessidade de novos ensaios diagnósticos que proporcionem maior confiabilidade quanto: (i) especificidade e sensibilidade (ii) definição de infecção passada ou recente e (iii) avaliação da atividade viral, em relação a doença hepática, seu prognóstico e a conveniência a terapia antiviral. Considerando as limitações observadas no uso dos ensaios imunológicos e a ausência de um sistema de cultura in vitro para o HCV, os métodos de detecção do genoma viral devem ser mais indicados para solucionar estes problemas, aprofundando o conhecimento dos mecanismos das infecções por HCV e, teoricamente, oferecendo um parâmetro mais adequado para diferenciar os pacientes virêmicos dos pacientes sem virêmia. Nesse campo de pesquisa, destaca-se a reação em cadeia da polimerase (PCR), onde ocorre a amplificação do genoma viral, para detectar o RNA-HCV no soro. A detecção do vírus da hepatite C processa-se através da transcrição reversa e subsequente amplificação do genoma viral através da PCR (RT-PCR), que possibilita o diagnóstico da infecção pelo vírus C antes de qualquer outro método tradicional. Por essa técnica, o RNA-HCV pode ser detectado no soro uma a duas semanas após a transfusão sanguínea, antes do início clínico da infecção pós-transfusional pelo HCV. A PCR, também, tem significativa aplicação nos casos onde o imunoensaio RIBA fornece resultados indeterminados ou não-reativos. Um ponto crucial na detecção do RNA-HCV é a escolha dos iniciadores para o uso diagnóstico, os quais devem corresponder as sequências genômicas bem conservadas nas diferentes variantes do HCV, de modo a garantir uma boa sensibilidade. No caso do HCV, pesquisa-se a região 5' não transcrita, que é a mais conservada dentro do genoma viral. Todos os protocolos dependem da reação de transcrição reversa, que faz a cópia de DNA complementar (cDNA), a partir do RNA viral extraído. O cDNA pode ser, então, amplificado pela PCR cujo produto pode ser analisado por eletroforese ou por um sistema de hibridização. Alguns pesquisadores tem utilizado, além da amplificação convencional, um ciclo adicional de amplificação com a utilização de iniciadores internos (Nested PCR). Essa técnica aumenta significativamente a especificiade e a sensibilidade da técnica de PCR original. Cada vez mais, tem-se demonstrado a importância da PCR na investigação da infecção pelo vírus da hepatite C, seja no reconhecimento do tipo de vírus infectante e posterior classificação ou na avaliação da carga viral. Estudos recentes tem sugerido que o genótipo do HCV e o nível de viremia estão associados com o desenvolvimento clínico da doença. Com relação ao genótipo, o HCV tipo 1b parece estar particularmente associado com doença crônica do fígado mais severa, cirrose e carcinoma hepatocelular, com ou sem o passo intermediário da cirrose. A quantidade de partículas virais no sangue também parece ser dependente do genótipo viral, uma vez que, pacientes infectados com HCV tipo 2 mostra um nível significantemente menor de RNA-HCV circulante. Outra importante aplicação da PCR para o HCV é o acompanhamento da resposta à terapia antiviral em pacientes com hepatite C crônica, em particular ao interferon α (IFNα). O IFNα promove o rápido decréscimo dos níveis séricos de alanina aminotransferase (ALT), a erradicação do genoma do HCV do soro e a melhora do estado de inflamação e necrose do fígado. Alta viremia do HCV (superior a 107 cópias/ml de soro) é prognóstico negativo para uma completa e adequada resposta ao tratamento com o IFN α. Portanto, a avaliação da eficácia terapêutica ao IFNα é mais adequadamente realizada pela quantificação do RNA- HCV, que somente é possível por técnicas moleculares. A quantificação do RNA viral, tem sido realizada por vários métodos de amplificação do RNA-HCV, o mais usualmente empregado é a PCR competitiva (Roche Monitor Kit). Nessa técnica, a amostra é diluida seriadamente e cada diluição é submetida à reação de amplificação juntamente com um controle interno, com o qual compete, revelando diferentes sinais. Outro ensaio também disponível é o “branched DNA” (Quantiplex, Chiron Corp), um método de amplificação de sinal de fase-sólida. Neste método, o soro é adicionado sob um suporte sólido, onde ocorre a lise do vírus, a captura e a hibridização do ácido nucleíco a ser detectado e a amplificação do sinal. Embora essas técnicas sejam muito sensíveis, os resultados obtidos tem mostrado variação do nível de viremia dos pacientes infectados. No caso do “branched DNA”, este demonstrou ser significativamente menos sensível (detecção limite 350.000 cópias/ml) do que o PCR competitivo (detecção limite aproximadamente 2000 cópias/ml). Um estudo recente de comparação entre 31 laboratórios mostrou uma substancial variação de sensibilidade e especificidade desses métodos. Portanto, verifica-se a necessidade de aprimoramento metodológico e aplicação das técnicas moleculares de forma mais rotineira na busca do diagnóstico precoce e do acompanhamento terapêutico adequado. Literatura recomendada CHOO, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science, 244: 359-62, 1989. DAVIS, G.L. et al. Quantitative detection of hepatitis C virus RNA with a solid-phase signal amplification method: definition of optimal conditions for specimen collection and clinical application in interferon-treated patients. Hepatology, 19: 1337-41, 1994. DI BISCEGLIE, A. et al. Long-term clinical and histopathological follow-up of chronic posttrasnfusion hepatitis. Hepatology, 14: 969-74, 1991.13 MATTSSON, L. et al. Outcome of acute symptomatic non-A, non-B hepatitis: a 13year follow-up study of hepatitis C virus markers. Liver, 13: 274-278, 1993. McPHERSON, R.A. . laboratory Diagnosis of Human Hepatitis Viruses. J. Clin. Lab. Analysis. 8: 369-377, 1994. MILLER, R.H. PURCELL, R.H. . Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with Pestiviruses and Flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 87: 2057-2061, 1990. OTHO, H. et. al. Transmission of hepatitis C virus from mothers to infants. N. Engl. 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A descoberta de Landsteiner do grupo sanguíneo ABO em 1900, estabeleceu o que se tornou a base para os estudos de parentescos dos dias modernos, porém a aplicação da descoberta para a determinação de paternidade, só foi demostrado em 1910 por von Dungern e Hirszfeld, conhecida como herança Mendeliana do grupo sanguíneo. O próximo evento significante ocorreu em 1927 quando o sistema MN foi descrito por Landsteiner e Levine. Este foi seguido pela descoberta, em 1939-1940, do sistema Rh-Hr por Levine, Stetsun, Landsteiner e Wiener. A aplicação do conhecimento desses sistemas fornece uma média de exclusão da paternidade de aproximadamente 55% dos homens supostamente acusados. A combinação dos sistemas ABO, Rh e MN, tornou possível excluir 70% dos homens caucasianos supostamente acusados da paternidade, e os testes de parentesco foram reconhecidos pelo seu valor de exclusão, mesmo que estes tivessem alcance limitado. Apesar dessas deficiências, esses testes foram utilizados até fins de 1960 e meados de 1970, quando a utilidade do sistema de antígenos leucocitários humanos (HLA) foi reconhecido legalmente e científicamente como um método para avaliação nos testes de paternidade. Os testes, usando múltiplos sistemas, incluindo o HLA, então forneceram um meio prático para a exclusão de pelo menos 95% dos supostos pais, no entanto, ainda não totalmente adequada para esse fim. Recentemente, técnicas baseadas no estudo de sequências polimórficas do DNA tem dado de forma muito segura a definição adequada para a identificação de indivíduos. A análise de sequências polimórficas no DNA é, atualmente, a ferramenta mais poderosa para distinguir geneticamente os indivíduos ou determinar níveis de relacionamento familiar. Os testes com DNA superam os resultados obtidos pelos métodos tradicionais, e podem solucionar de forma segura os resultados tidos como inconclusivos pelos métodos considerados tradicionais. Por essas razões, foram realizadas uma série de estudos de marcadores genéticos para determinar a real definição de um vínculo familiar. A crescente demanda de testes de identificação, estimulou a comunidade científica a desenvolver metodologias com maior grau de discriminação que permite com segurança incluir ou excluir a paternidade ou relação familiar. Esses marcadores genéticos são características herdadas que diferenciam os indivíduos uns dos outros e são controlados por genes localizados em um par de cromossomos, denominados alelos. Apenas dois alelos estão envolvidos na formação de uma característica específica, um do pai outro da mãe. Quando o par de genes for idêntico, é chamado de homozigoto; quando o par de genes for diferente, de heterozigoto. É necessário também uma escolha adequada dos alelos para um estudo detalhado da ocorrência, a fim de aumentar a precisão e exatidão no resultado final. • Repetições Sucessivas de Número Variável (VNTR) e Repetições Sucessivas Pequenas (STR) Vários locos de DNA são amplamente utilizados em análises forenses, os mais utilizados são aqueles contendo as denominadas Repetições Sucessivas de Número Variável ((Variable Number “ Tandem Repeat). Estas sequências não codificam um gene específico, podendo assim serem utilizadas para análises forenses sem nenhuma consequência ao indivíduo. Isto é uma vantagem pois as VNTR são menos suscetíveis a seleção natural, que poderia levar a diferentes frequências de alelos em populações diferentes. As VNTR tem sido também denominadas de minisatélites. Uma região típica de VNTR consiste de 500 a 10,000 bp, compreendendo várias unidades de repetições sucessivas, cada uma com 15 a 35 bp em comprimento. O número exato de repetições assim como o comprimento da região de VNTR, varia de um alelo para outro, e diferentes alelos podem ser identificados pelo seu comprimento. Os locos VNTR são particularmente convenientes como marcadores para identificação, pois eles possuem um grande número de alelos diferentes, geralmente 100 ou mais, embora apenas 15 a 25 possam ser distinguidas (A palavra alelo é tradicionalmente aplicada como forma alternativa de um gene; entretanto, pode-se extrapolar o significado para regiões não gênicas do DNA, como as VNTR). As VNTR tem uma alta taxa de mutação, levando as mudanças no comprimento. Uma mutação individual usualmente muda o comprimento por apenas uma ou poucas unidades de repetição. O resultado é um grande número de alelos na população com diferentes sequências. O número de possíveis genótipos em um loco é muito maior que o número de alelos, e quando diversos locos são combinados, o número total de genótipos é muito grande. Famílias de microsatélites de DNA compreendem arranjos de repetições consecutivas de pequeno tamanho (“Short Tanden Repeat”, STR), que apresentam sequências simples (1-4 bp) e estão localizados ao longo do genoma. Normalmente repetições dos mononucleotídeos A e T, são comuns e juntos são responsáveis por cerca de 10 Mb ou 0,3% do genoma nuclear. Em contraste, sequências de G e C são bem mais raras. No caso de repetições de dinucleotídeos, arranjos de repetições CA (repetições de TG na fita complementar) são comuns, compreendendo 0,5% e são altamente polimórficos. Repetições CT/TG são também comuns, ocorrendo em cada 50 kb, em média, e sendo responsável por cerca de 0,2% do genoma. Por outro lado, sequências de CG/GC são raras. Isso se deve ao fato de que resíduos de C ligados em sua extremidade 3’ por um resíduo G (CpG) são suscetíveis à metilação e desaminação, resultando em TpG (ou CpA na fita complementar). Repetições consecutivas de trinucleotídeos e tetranucleotídeos são raríssimas, porém altamente polimórficas, sendo candidatas a marcadores genéticos do polimorfismo entre indivíduos. • RFLP na Identificação de Indivíduos A maioria do DNA no genoma humano não parece codificar genes específicos, mas parece ter um papel na integridade estrutural do cromossomo ou em sua replicação. Como vimos, o DNA não codificante contém várias sequências repetitivas, sendo possível a análise de DNA para identificação de indivíduos. A garantia de que o DNA apresenta repetição única para cada indivíduo, ou polimorfismo, o torna singular pelo número característico dessas repetições. Neste contexto, essa caracteríctica muito singular pode servir como parâmetro muito importante na caracterização de um indivíduo, porque diferentes tamanhos de fragmentos de DNA são encontrados, após digestão do DNA com enzimas de restrição, e hibridização com sondas alelo-específicas. Considerando a frequência desses fragmentos polimórficos na população e possíveis variações étnicas, o teste de DNA tem a capacidade de fornecer as probabilidades mais exatas de inclusão ou exclusão de indivíduos num contexto forense ou de vínculo familiar. Consequentemente muita atenção tem sido dada para a padronização desses novos métodos em laboratórios forenses. Técnicas similares tem sido usadas para teste de paternidade em casos legais. Uma aplicação potencial é a análise da sequência dos nucleotídeos nos gens HLA para definir identidade imunológica. Essa aplicação fornece uma oportunidade para se encontrar os melhores doadores. Uma outra aplicação seria estabelecer suscetibilidade a patologias autoimunes em indivíduos com alterações específicas nos genes HLA. Os locos de VNTR consistem em numerosas cópias de sequências simples de DNA, em um intervalo de comprimento que varia de 9 a 14 pares de base (bp), alinhados de forma contínua. Estudos sobre populações humanas tem revelado que o número de repetições sucessivas presentes em um determinado loco pode exibir uma grande variação de um indivíduo para outro, dessa forma se estabelecem como marcadores genéticos que são altamente informativos de acordo com o espécime biológico. O uso de vários locos VNTR independentes e hipervariáveis fornecem informação muito importante condiderando uma fonte de espécime biológico a ser identificado. A análise por RFLP de locos de VNTR envolve a purificação do DNA de fluídos corporais ou esfregaços de biópsias, seguida da digestão do DNA com a enzima de restrição (p. ex. Hae III). Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese, utilizando gel de agarose; Os fragmentos