Baixe Apostila de Cromatografia Gasosa e outras Notas de estudo em PDF para Química, somente na Docsity! CEFET Quím ica – Analise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 SUMÁRIO A. INTRODUÇÃO B. O QUE É A CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA C. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS D. DETECTORES E. MÉTODOS QUANTITATIVOS F. BIBLIOGRAFIA CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 2 A. INTRODUÇÃO A cromatografia faz parte de um importante grupo de métodos de separação, que nos permite separar, isolar, identificar e quantificar substâncias, mesmo em misturas muito complexas. Existem várias técnicas cromatográficas, que vão das mais simples, como a cromatografia sobre papel, até as mais sofisticadas e computadorizadas, como a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O ponto comum entre essas técnicas, e que caracteriza o método, é o fato dos componentes da mistura, ou amostra, serem distribuídos entre duas fases. Uma delas permanece fixa, e por isso é chamada de fase estacionária (F.E.), enquanto a outra percola1 através da F.E., sendo então chamada de fase móvel (F.M.). Esta situação dinâmica, resulta numa migração diferencial, ou seja, os componentes da amostra têm diferentes velocidades ao passarem pela fase estacionária. A tabela abaixo mostra algumas combinações de fases estacionárias e fases móveis: Fase Móvel Fase Estacionária Abreviatura Mecanismo de separação Tipo de cromatografia líquido sólido C L S adsorção cromatografia líquida gás sólido C G S adsorção cromatografia gasosa líquido líquido C L L partição cromatografia líquida gás líquido C G L partição cromatografia gasosa Cada uma dessas combinações envolve diferentes mecanismos de separação. Por exemplo, na CLS acontece, em geral: adsorção na superfície do sólido e interação resultante da troca iônica ou da formação de complexos. Na CGS também ocorre, de maneira geral, o fenômeno da adsorção. Na CLL ocorre a partição definida pela solubilidade relativa do soluto nos dois líquidos. Na CGL dá-se a partição do soluto definida pela pressão parcial de vapor do soluto na solução. A fase estacionária, de forma geral, é acondicionada nas chamadas colunas cromatográficas, que na sua maioria são tubos de vidro ou metal de dimensões diversas. Quando essa fase é um sólido, basta que a coluna seja preenchida com o mesmo, de acordo com técnicas especiais. Por outro lado, quando a fase estacionária é um líquido, esse pode tanto revestir as paredes da coluna, no caso de colunas capilares, quanto estar aderido a um suporte sólido com o qual se enche a coluna. A amostra é introduzida na coluna e a fase móvel carreia os diversos componentes dessa amostra através da coluna e, dependendo do tipo de cromatografia, pode participar ou não da separação. Assim, a separação dos diversos componentes será dada em função de uma maior ou 1 Percolação é o nome dado ao movimento (infiltração) das águas pluviais no subsolo. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 5 Como o detector não responde à passagem do gás de arraste, observa-se uma linha reta, constante, entre cada sinal, chamada Linha de Base. Quando a substância A alcança o detector, este é sensibilizado, envia um sinal ao registrador e o registro gráfico esperado é o observado na figura 3. Entretanto isso só seria possível se todas as moléculas da substância A alcançassem o detector simultaneamente. Na verdade acontece, entre outras coisas, o fenômeno da difusão longitudinal no interior da coluna, que faz com que as moléculas da mesma substância percorram a coluna com velocidades levemente diferentes. Isto faz com que o aspecto real de um cromatograma de uma amostra contendo três substâncias (A, B e C) seja como o que se vê na figura 4. Fig. 4 - Cromatograma real de uma amostra contendo três substâncias. A cromatografia gasosa permite a realização de análises qualitativas e quantitativas. A análise qualitativa é baseada na velocidade com que cada componente da mistura atravessa a coluna, utilizando-se o parâmetro Tempo de Retenção (Tr). O tempo de retenção de uma substância é o tempo gasto desde o momento em que a amostra é injetada, até o momento em que o maior número de moléculas da substância sai do sistema cromatográfico e é detectado. O Tr é calculado dividindo a distância (espaço entre o início do cromatograma e o ponto máximo do pico formado) pela velocidade do papel do registrador. O tempo de retenção é característico de uma dada substância, em condições determinadas de análise. Dessa forma, para uma dada coluna, um dado gás de arraste e condições de temperatura e pressão estabelecidas, cada substância tem um tempo de retenção próprio, que permite a sua identificação através da comparação com a análise de padrões, realizada sob as mesmas condições. A análise quantitativa está relacionada com a área formada sob os picos, pois a intensidade do sinal enviado pelo detector é proporcional à quantidade de substância presente na amostra. Para se realizar uma análise cromatográfica é necessário que o cromatograma obtido esteja bem "resolvido". Este termo, "resolvido", significa boa separação entre os picos, de tal forma que se possa determinar com precisão, tanto os Tr (s) como as áreas dos mesmos. Na prática, controlando- se adequadamente os parâmetros cromatográficos, pode-se obter um registro cromatográfico com picos bem separados e simétricos, isto é, com boa resolução. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 6 EXERCÍCIOS 1) Na cromatografia gasosa, o tempo de retenção é determinado por alguns parâmetros. Para substâncias com peso molecular próximo, portanto, tem maior tempo de retenção aquela que: ( ) mais interage com a fase estacionária. ( ) tem menor pressão de vapor. ( ) menos interage com a fase móvel. ( ) for mais polar. Justifique a sua resposta tanto para as afirmativas corretas como para as incorretas. 2) Por que o tempo de retenção de séries homólogas de substâncias é maior quanto mais pesada for a substância, na grande maioria das fases estacionárias usadas em CG, sendo essa ordem independente da polaridade da fase utilizada? 3) Dentre as alternativas abaixo, a única análise qualitativa que é impossível se fazer por cromatografia a gás é o teor de: A- ( ) metanol em bebidas alcoólicas. B- ( ) n-octano em gasolina. C- ( ) açucar no mel. D- ( ) óxido nitroso em ar atmosférico poluído. E- ( ) metano em gases proveniente de biodegradação. 4) Para fazer uma análise cromatográfica, um analista injetou 1,0 L de uma substância pura X (grau PA) e após um determinado tempo observou a formação do cromatograma 1 com dois picos. Surpreso com o resultado obtido, reinjetou novamente a referida substância pura nas mesmas condições cromatográficas, obtendo o cromatograma 2. Explique o aparecimento do sinal com menor tempo de retenção no cromatograma 1. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 7 5) O esquema abaixo mostra um cromatógrafo improvisado. A detecção é feita pelo contraste da cor da chama das substâncias orgânicas (normalmente amarela e luminosa) contra a chama incolor do hidrogênio. Como poderia ser feita neste cromatógrafo: A) A análise qualitativa de uma mistura de pentano e benzeno? B) A diferenciação de duas soluções de benzeno com concentrações distintas? C. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS C.1. ESCOLHA DA TEMPERATURA DO FORNO DAS COLUNAS Como a cromatografia gasosa utiliza um gás como fase móvel, é coerente pensar que as substâncias a serem analisadas devem estar no estado gasoso no momento em que penetram no interior da coluna. Quando as substâncias componentes de uma mistura entram em contato com a fase estacionária iniciam-se vários tipos de interações que irão influenciar na migração diferenciada de cada substância. Um fenômeno que em geral ocorre com todas as substâncias é o de ter, cada uma, o seu equilíbrio Líquido Vapor deslocado para a fase vapor, quanto mais aquecido estiver o forno da coluna. Quanto menos aquecido estiver o forno da coluna, esse equilíbrio também estará menos deslocado para a fase vapor. Dessa forma, conclui-se que uma substância eluirá mais rapidamente quanto mais aquecido estiver o forno da coluna e, por outro lado, a substância ficará mais tempo em contato com a fase estacionária, quanto menos aquecido estiver o forno. Consequentemente, os valores de Tr serão modificados à medida em que se altera a temperatura do forno das colunas. A ordem de saída das substâncias, entretanto, será regida por dois fatores simultâneos, que são: a afinidade de cada substância pela fase estacionária e a tendência de cada substância se manter CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 10 O diâmetro do grão (suporte) é muito importante, pois deseja-se uma grande superfície de contato para que as interações ocorram. Quanto menor o tamanho do grão, para um mesmo volume de coluna, maior a superfície de contato da fase, retida sobre o grão, com a substância (soluto). Porém, nas baixas pressões de trabalho da cromatografia gasosa, não é indicada uma granulometria muito baixa, pois os grãos irão atuar como uma barreira à passagem do gás, dificultando o processo de separação. Normalmente utiliza-se uma granulometria da ordem de 80 a 100 mesh. No caso de coluna capilar, esse fenômeno de barreira não existe e a fase é depositada sobre a parede interna do "tubo capilar" por onde se fará passar a amostra. Para se aumentar a superfície de contato da fase estacionária com o soluto, trabalha-se com colunas longas. O diâmetro interno pode variar de 0,10 a 0.53 mm e a espessura do filme líquido depositado na superfície interna do tubo capilar é normalmente de 2,5 m. Tabela 1 – Principais características das colunas empacotada e capilar Características Empacotada Capilar Comprimento (m) 1 - 5 5 - 60 Diâmetro Interno (mm) 2 - 4 0.10 - 0.53 Pratos por metros 1.000 5.000 Pratos totais (aproximadamente) 5.000 300.000 Resolução Baixa Alta Fluxo (mL/min) 10 - 60 0.5 – 2.0 Capacidade 10 µg / pico <100 ng / pico Espessura do filme líquido (µm) 10 0.1 – 5.0 C.4. ATENUAÇÃO O atenuador é um dispositivo relacionado com a intensidade de corrente elétrica enviada ao registrador. O sinal elétrico é reduzido com a presença de resistências associadas ao circuito que liga o detector ao registrador. Assim, o sinal que chega ao registrador é reduzido. Isto não altera a resolução dos picos, mas modifica o tamanho dos mesmos. Fig. 6 - Esquema simplificado do sistema de atenuação. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 11 C.5 ÁREA DO PICO A quantidade de substância injetada vai gerar um sinal no detector. Quanto maior a quantidade, maior o sinal elétrico. De acordo com a difusão longitudinal, as moléculas não saem todas juntas, gerando um conjunto de sinais em forma de pico para cada substância que alcança o detector. A quantidade de substância então será proporcional à área do pico cromatográfico. Como esta área é obtida através da contagem de sinais elétricos, normalmente ela não tem unidade. EXERCÍCIOS 1) Assinale o parâmetro cromatográfico que quando é alterado não afeta o tempo de retenção de uma determinada substância. A- ( ) temperatura do forno das colunas. D- ( ) polaridade da fase estacionária. B- ( ) vazão do gás de arraste. E- ( ) % de fase estacionária no suporte sólido. C- ( ) temperatura do forno do detector. 2) Após a injeção de 2,0 L de uma certa solução amostra, em atenuação 100x, achou-se para uma certo componente, uma área de 12.000. Usando-se um volume injetado de 1,0 L e atenuação 500x, considerando as demais condições iguais, a nova área do pico esse componente será: A- ( ) 1.200 B- ( ) 6.000 C- ( ) 12.000 D- ( ) 24.000 E- ( ) 60.000 3) Uma amostra contendo quatro componentes originou o cromatograma a seguir: Ao diminuir-se a temperatura de análise, obteve-se o seguinte resultado: Explique quais as possíveis causas que originaram a obtenção de cromatogramas diferentes e quais as formas de confirmar isso. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 12 4) Um cromatograma obtido num cromatógrafo a gás apresentou o seguinte aspecto: Um analista desejando otimizar as condições de análise, introduziu algumas alterações no cromatógrafo, uma por vez. Diga quais foram as alterações para cada um dos cromatogramas a seguir: 5) Um analista injetou 0,5 L de água deionizada em cromatógrafo a gás com atenuação = x 10, coluna Porapak-Q com 3,0 metros de comprimento, vazão do gás de arraste de 40 mL/min, temperatura das colunas = 70ºC; temperatura do vaporizador = 120ºC; temperatura do detector = 200ºC; velocidade do papel = 2,0 cm/min, obtendo o cromatograma ao lado: Considerando que o analista esperava obter um só pico, uma explicação plausível para o cromatograma obtido é: A-( ) a temperatura do forno da coluna estava abaixo do ponto de ebulição da água. B-( ) a temperatura do forno do detector estava muito alta decompondo assim a amostra. C-( ) a vazão do gás de arraste estava muito baixa, favorecendo a difusão dos gases. D-( ) a amostra foi introduzida no vaporizador em tempos distintos havendo erro na injeção. E-( ) a amostra estava contaminada com NaCl proveniente da resina trocadora de íons. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 15 10) Um analista realizou uma análise de ésteres metílicos lineares com 10, 11 e 12 átomos de carbono a 120oC utilizando uma coluna de DEGS, obtendo o cromatograma abaixo: Utilizando as mesmas condições de análise, o analista injetou alcanos lineares de 10, 11 e 12 átomos de carbono, obtendo o cromatograma abaixo: A) A fase estacionária é polar ou apolar? B) Qual a provável ordem de saída dos compostos nos dois cromatogramas? C) O que deveria ser feito para melhorar a primeira análise, utilizando a mesma coluna? D) Como você faria uma análise qualitativa no 2O cromatograma? E) O que aconteceria se fosse alterada a velocidade do papel? F) Se fossem misturados esses alcanos e ésteres, como ficaria o cromatograma, nas mesmas condições cromatográficas? O que deveria ser feito para otimizar o cromatograma da mistura? 11) O que ocorrerá numa análise cromatográfica se: a) a temperatura do injetor é inferior ao ponto de ebulição de um componente da amostra? b) o volume injetado é muito grande? c) a temperatura da coluna é aumentada além da temperatura máxima recomendada? d) a temperatura do detetor for diminuida? e) injetar-se, distraidamente, uma solução de NaOH. f) a temperatura da coluna é inferior ao ponto de ebulição de um componente da amostra? g) o septo do injetor estiver muito furado? h) a temperatura do injetor for muito alta? CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 16 12) Observe a tabela de tempos de retenção relativos2 para a H2O, n-propanol e heptano em várias colunas. Fase estacionária Carbowax 20M SE-30 Glicerol DEGS Esqualano Temperatura da coluna 70oC 70oC 50oC 70oC 60oC água 6 1 90 1 1 n-propanol 4,3 1,5 2,3 4 2,5 heptano 1 7 1 1,2 10 Em função da magnitude dos valores de retenção relativa encontrados e da polaridade das substâncias analisadas, colocar as fases em ordem crescente de polaridade. Justifique. 13) A reação do resorcinol ( I ) com o iodeto de metila (MeI) em condições estequimétricas (1:1 em mol) fornece uma mistura dos produtos ( II ) e ( III ), além de uma certa quantidade de ( I ) que não reagiu. A reação é: OH OH OMe OH OMe OMe + MeI + ( I ) ( I I ) ( I I I ) O cromatograma A representa a injeção da mistura equimolar de ( I ) e MeI antes de reagir, enquanto que o cromatograma B corresponde à injeção de uma alíquota do meio reacional após meia hora de reação. A partir de então, a cada intervalo de meia hora, retirou-se alíquotas do meio reacional e o aspecto dos cromatogramas obtidos não foi diferente do cromatograma B, indicando que a reação havia chegado ao equilíbrio. Observe os cromatogramas abaixo e responda: a) A provável ordem de saída, sabendo que a fase é polar. b) Por que o sinal 4 é mais largo que os demais? c) Se utilizasse uma quantidade bem maior, em moles, de MeI em relação a I, obter-se-ia após um determinado tempo, um cromatograma com somente dois picos. Explique e desenhe o referido cromatograma. 2 Retenção relativa é a razão entre os tempos de retenção de duas substâncias, ou seja, Trx/Trref. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 17 14) A reação de desidratação do etanol (CH3CH2OH CH2CH2 + H2O) foi monitorada por cromatografia. Após 5 minutos de reação, obteve-se o cromatograma ao lado, onde L1 = 3,00 cm, L2 = 4,80 cm e L3 = 7,50 cm. Vel. do papel = 12 cm/min. Decorridos 15 minutos, nova injeção foi realizada nas mesmas condições anteriores, obtendo-se o seguinte cromatograma: Outros dados obtidos a partir do cromatograma foram reunidos na tabela abaixo: Dados 1o cromatograma 2o cromatograma b (base) h (altura) b (base) h (altura) Pico 1 0,20 0,40 2,30 3,50 Pico 2 2,30 6,20 2,00 4,02 Pico 3 0,10 0,20 1,35 2,70 a) Qual a razão entre as massas de etanol no primeiro e segundo cromatograma? b) Qual a ordem de saída dos componentes na coluna, já que a fase estacionária é polar? Justifique. c) Qual o tempo de retenção de cada substância? d) Sabendo-se que o éter dietílico é um produto secundário da reação, onde ele poderia aparecer num outro cromatograma obtido após a injeção dos dois primeiros? e) Caso o pico do éter fosse obtido fundido ao seu vizinho no terceiro cromatograma, o que você faria para tentar separá-los? D. DETECTORES Até esse momento, foram apresentados todos os componentes de um sistema cromatográfico à gás. Entretanto, faz-se necessária uma complementação sobre o princípio de funcionamento dos detectores, para que se possa compreender melhor como a presença de substâncias nos mesmos pode ser convertida em sinal elétrico. Atualmente existem vários tipos de detectores, com princípios de funcionamento completamente diferentes. Se verá neste capítulo os dois mais largamente utilizados, que são o detector de condutividade térmica (DCT) e o detector de ionização em chama (DIC). D.1. DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT) Baseia-se na capacidade das substâncias de conduzirem calor. Essa característica depende da estrutura molecular de cada substância. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 20 O DCT responde a todos os tipos de compostos orgânicos e inorgânicos que possam ser analisados por CG e não é destrutivo, tornando-se muito útil para trabalhos em escala preparativa. D.2. DETECTOR DE IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC) Baseia-se na condutividade elétrica dos íons formados na chama do detector. A condutividade elétrica de um gás é proporcional à concentração das partículas com carga dentro do volume de gás. Nesse detector, tem-se inicialmente somente a passagem do gás de arraste e a quantidade de íons produzidos é bem pequena. Quando um composto orgânico passar pela chama, haverá uma produção maior de cargas devido à formação de íons e elétrons livres, dentre outros, gerando um aumento na corrente. Um esquema do DIC é mostrado a seguir: Fig. 12 - Detector de ionização em chama. Tem-se a chama formada por ar (O2) e hidrogênio e, lateralmente, dois eletrodos com potencial aplicado por uma fonte externa. A chama de hidrogênio produz poucos íons, em comparação com outras substâncias combustíveis. Quando um composto orgânico passa pela chama, formam-se mais íons, aumentando a corrente, que é amplificada, originando, posteriormente, o pico cromatográfico no registrador. O DIC só responde aos átomos de carbono oxidáveis. A intensidade de resposta decresce à medida em que aumenta a substituição por halogênios, grupos amina ou grupos hidroxila. Como se comportará o DIC quando passarem pela chama substâncias tais como H2O, CO2 ou CS2 ? E quanto aos compostos inorgânicos? CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 21 Tabela 3 - Comparação entre os dois detectores Tipo de Detector D.C.T. D.I.C. Faixa de linearidade 105 107 Quantidade mínima detectável 10 ng 10 pg Sensibilidade do detector menor maior Universo de substâncias detectáveis universal seletivo Conservação das amostras não-destrutivo destrutivo Controle da temperatura rigoroso não rigoroso Existem outros tipos de detectores que são mais seletivos, como por exemplo: o detector de captura de elétrons e o detector fotométrico. O primeiro é utilizado para análise de compostos halogenados, anidridos, peróxidos, nitrilas e organo-metálicos, dentre outros. O segundo é utilizado normalmente para análise de compostos sulfurados e fosforados. EXERCÍCIOS 1) Explique porque os cromatógrafos à gás com detectores de condutividade térmica, normalmente, operam com 2 colunas ao invés de uma só. 2) Os cromatogramas abaixo apresentam uma análise feita por cromatografia gasosa, onde fez-se a amostra passar simultaneamente por dois detectores (ionização em chama, DIC e condutividade térmica, DCT). Comente as diferenças presentes nos dois cromatogramas em termos de sensibilidade e seletividade e indique o procedimento mais indicado para quantificar as substâncias A e B presentes na amostra. Considere os sinais positivos para ambos os detectores. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 22 3) Um detector termossensível baseia-se no fato de que a resistividade de um filamento varia com a temperatura, emitindo então sinais que são registrados. Das duas montagens abaixo, qual seria a melhor e por que? Considere os circuitos elétricos utilizados e que a voltagem da fonte pode oscilar. 4) Uma análise realizada em cromatógrafo a gás com DCT forneceu o seguinte cromatograma: Seria vantajoso fazer a análise em um cromatógrafo a gás com DIC ? Explique. 5) Correlacione as colunas: 1- Injetor ( ) Compõe a fase móvel na CG 2-Gás de arraste ( ) Promove a separação cromatográfica 3- Manômetro ( ) Vaporiza a amostra 4- Coluna ( ) Promove o aquecimento do detector 5- Forno ( ) Envia sinal elétrico para o amplificador 6- Detector ( ) Controla a pressão do gás CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 25 10) Observe os cromatogramas A e B obtidos a partir de uma mistura gasosa com concentrações molares iguais de metano, metanol e vapor d’água em uma coluna de característica polar, um detetor de condutividade térmica e um tipo de gás de arraste para cada cromatograma (considere as demais condições cromatográficas iguais). Com base na intensidade dos sinais obtidos, na ordem de saída mais provável e nos valores de condutividade térmica dados (unidades relativas), os gases de arraste usados em cada cromatograma são, respectivamente: H2 = 44,5 He = 36,0 CH4 = 8,22 N2 = 6,24 H2O = 4,25 CH3OH = 1,00 ( ) hélio e nitrogênio. ( ) nitrogênio e hélio. ( ) hidrogênio e hélio. ( ) hélio e hidrogênio. ( ) nitrogênio e hidrogênio. E.MÉTODOS QUANTITATIVOS E.1. INTRODUÇÃO A área sob um pico cromatográfico, originado a partir da passagem de uma determinada substância pelo detector, é proporcional à quantidade presente na amostra dessa mesma substância. Logo, a determinação dessa área servirá para quantificar o constituinte da amostra. O cálculo da área pode ser feito por algumas técnicas de integração. Mas, para que esse valor de área possa realmente expressar uma concentração, são necessárias algumas condições: 1. A existência de padrões com pureza confiável que possam ser utilizados nos cálculos. 2. Os compostos de interesse não podem sofrer decomposição térmica ou decomposição catalítica no sistema cromatográfico e nem ficarem retidos permanentemente. 3. O pico de interesse deve corresponder somente a uma substância, ou seja, não tenha ocorrido coeluição. 4. A quantidade de massa analisada esteja na faixa linear de resposta do detector, do amplificador e do sistema de integração. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 26 5. Dependendo do método de cálculo, o operador deve ter conhecimento da existência ou não de substâncias não detectáveis e/ou não eluídas. 6. Repetibilidade na operação do cromatógrafo, isto é, as temperaturas e vazões utilizadas, etc, para que se possa reproduzir corretamente os dados de retenção e resolução. 7. Amostragem correta do sistema a ser analisado. 8. Precisão e exatidão à altura das exigências do método analítico na determinação das áreas dos picos. 9. Análise das fontes de erro ao longo de todo processo para que o resultado final seja expressado com a precisão correta. E.2. DETERMINAÇÃO DAS ÁREAS DOS PICOS A escolha do método a ser utilizado na determinação das áreas dependerá da precisão e exatidão desejadas, do tempo e recursos humanos, técnicos e financeiros disponíveis. Como exemplo, a tabela 4 mostra os resultados da determinação das áreas do cromatograma de uma mesma amostra feitos por diferentes técnicas de integração. Tabela 4 - Comparação das técnicas de integração de áreas planímetro triangulação HL (1/2 H) cortar e pesar disco de bola digital Área média C.V. % Área média C.V. % Área média C.V %. Área média C.V. % Área média C.V. % Área média C.V. % Propano 0,04 20 0,05 14 0,04 12 0,01 14 0,04 18 0,03 10 Isobutano 4,8 1,7 4,8 8,7 4,5 3,8 5,0 2,0 4,6 0,4 4,6 0,9 n-Butano 14,0 5,6 13.7 4,5 13,6 1,6 15,0 2,8 14,1 1,0 14,1 0,4 1-Buteno 18,5 3,3 18,5 4,8 18,6 3,1 18,4 1,2 18,7 2,5 18,7 0,3 trans-2-Buteno 20,2 6,5 20,3 3,3 20,1 2,0 20,1 1,4 20,2 1,1 20,2 0,2 cis-2-Buteno 16,1 3,7 15,8 1,6 16,4 3,7 15,9 1,5 16,1 0,7 16,0 0,4 Butadieno 18,2 2,0 18,3 1,8 18,2 1,7 17,6 1,2 18,3 0,7 18,3 0,5 Isobuteno 8,1 5,7 8,6 3,7 8,6 2,2 8,0 2,1 8,1 2,6 8,2 0,5 Tempo de cálculo (min) 45/60 45/60 50/60 100/120 15/30 5/10 D.D.R. 4,1 4,1 2,6 1,7 1,3 0,4 C.V.= coeficiente de variação D.D.R.= desvio relativo ao valor real A escolha do método de análise quantitativa depende da precisão desejada, do tempo necessário, do custo e do equipamento disponível no laboratório para efetuar as medições e, CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 27 também, do aspecto dos picos. A combinação de todos esses fatores é que vai definir o método a ser adotado. E.3. CÁLCULOS QUANTITATIVOS Quatro métodos são geralmente utilizados na determinação quantitativa dos componentes da amostra3: normalização interna, normalização de áreas, padronização externa e padronização interna. E.3.1. NORMALIZAÇÃO INTERNA A área de um sinal cromatográfico é dada pela equação a seguir e é proporcional à concentração da substância que passa pelo detector: A V x Ck x S t inj Onde S é a área do pico, determinada no cromatograma, k é a cte. de proporcionalidade que depende da interação da substância com o sistema de detecção, C é a concentração da substância eluída, Vinj é o volume injetado e At é a atenuação. Se o valor de k é o mesmo para todos os componentes da amostra e se também todos eles estiverem devidamente registrados no cromatograma, pode-se considerar que o percentual de área corresponde ao percentual de massa. Como exemplo, observe o cromatograma de uma amostra que contém somente as substâncias A, B e C (figura 13). Fig. 13- Cromatograma das substâncias A, B e C. A determinação quantitativa da substância "B" no cromatograma acima seria simplesmente a porcentagem de sua área em relação à área total, isto é: % B = B S S i 1 0 0 CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 30 No cromatograma 1, relativo à uma amostra complexa, são registrados doze sinais. O cromatograma 2 corresponde a uma solução padrão da substância que gerou o pico no 11. Supondo que o problema em questão fosse quantificar nessa amostra, um determinado componente X que gerou o pico no 11, você seria capaz de listar os motivos pelos quais não é possível lançar mão da técnica de normalização nesse caso? Uma solução plausível para casos como esse é a técnica da padronização externa, onde é preparada uma solução padrão contendo somente a(s) substância(s) de interesse na amostra. A comparação com um padrão externo é possível, baseando-se no pressuposto de que uma substância X terá o mesmo fator de resposta quando presente na amostra ou em uma solução padrão. Pode-se considerar as relações matemáticas a seguir: S f C V A tx x x in j no cromatograma 1 S f C V A tx x x in j' ' ' ' no cromatograma 2 Onde Sx e S’x são, respectivamente, as áreas que a substância X gerou nos cromatogramas da amostra e do padrão; Cx e C’x se referem, respectivamente, às concentrações de X nas soluções amostra e padrão, fx é o fator de resposta da substância X frente ao detector utilizado, Vinj e V'inj os volumes injetados de amostra e de padrão e At e At’ são as atenuações de trabalho em cada cromatograma. fX e C'x são as incógnitas que podem ser determinadas pelas duas equações. Para melhorar a precisão do método e também verificar a faixa de linearidade pode-se construir uma curva de calibração (área concentração). Os volumes injetados e a atenuação a diferentes concentrações dos padrões da substância de interesse deverão ser os mesmos6. O procedimento adotado para fazer a curva de calibração é simples: a) Prepara-se padrões da substância a ser analisada. b) Injeta-se os padrões, um a um, e determina-se as áreas pertinentes à substância de interesse. 6 Obviamente, alguns outros parâmetros que podem alterar a área ou a sensibilidade analítica como a temperatura do forno do detector, corrente de alimentação para o DCT, vazão do gás de arraste, etc. deverão ser constantes. A atenuação de trabalho e o volume injetado fazem parte da constante no gráfico. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 31 Observando-se o exemplo da figura 15 e considerando C1< C2< C3< C4< Cn , tem-se que: Curva de calibração - Padronização Externa Concentração Área Fig. 15 - Curva de calibração na padronização externa. Como outros métodos analíticos, a determinação da concentração desconhecida na solução injetada, a partir da curva de calibração, é feita por interpolação gráfica da área no cromatograma da amostra ou pela equação da reta determinada por regressão linear. Como sempre, há incerteza quanto ao volume injetado, principalmente, quando são utilizadas microsseringas7. Vantagens : basta determinar a(s) área(s) do(s) pico(s) de interesse. independe da detecção de todos os picos. serve para amostras mais complexas. é possível usar essa técnica quantitativa na análise de traços. pode-se trabalhar com curva de calibração. Limitações : depende do volume injetado. depende da estabilidade do cromatógrafo e do detector. 7 A utilização de válvulas de injeção com volumes fixos acarreta menor erro de injeção. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 32 E.3.4. PADRONIZAÇÃO INTERNA Como visto anteriormente, na técnica de padronização externa corre-se o risco de não se analisar a amostra exatamente nas mesmas condições dos padrões. Isso pode acarretar erros nos cálculos das concentrações, principalmente com os erros do volume injetado. Por outro lado, isso não é problema na normalização, já que os cálculos (percentual em área e fator de resposta relativo) são feitos a partir da relação entre as áreas de dois picos num mesmo cromatograma. Assim, alterações que ocorram na sensibilidade do detector e, principalmente, no volume injetado, afetarão os dois picos de modo igual, não interferindo dessa forma no cálculo quantitativo final. A padronização interna é uma técnica na qual um padrão é injetado concomitantemente à amostra desconhecida, isto é, ele é dissolvido na própria amostra e servirá de base para os cálculos quantitativos da substância a ser analisada a partir de uma relação de áreas. A técnica é similar à padronização externa, porém, como veremos adiante, o volume injetado agora é um parâmetro que pouco afeta a análise. O grande problema é escolher um padrão interno8 adequado para a amostra a ser analisada pois este deve atender aos seguintes requisitos: Não pode estar presente na amostra. Deve ter comportamento cromatográfico similar ao da substância a ser analisada. Estar numa concentração conhecida. Ser estável termicamente. Não ficar adsorvido permanentemente na fase estacionária. 8 Essa técnica é restrita a soluções líquidas, dada a dificuldade em adicionar, com precisão, padrões internos gasosos em amostras gasosas. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 35 EXERCÍCIOS 1)Uma amostra de três substâncias A, B e C foi analisada cromatograficamente e foram obtidos 3 picos distintos. O papel que registrou estes picos foi recortado no formato de cada um deles, de modo que cada pico foi pesado numa balança analítica e obteve-se 0,5710 g, 0,2230 g e 0,1240 g para A, B e C, respectivamente. Supondo que o papel tenha peso uniforme, calcule a % de B na amostra, levando em conta que o fator de resposta do detector é igual para as três substâncias. 2)Há possibilidade de se fazer uma análise por cromatografia gasosa se a constante k for diferente para cada componente da amostra? Justifique, descrevendo o procedimento a ser efetuado. 3)O cromatograma A corresponde a uma alíquota de 1,5 L de uma amostra contendo somente as substâncias A, B, C, D e E, e o cromatograma B a uma alíquota de 1,0 L de uma mistura padrão (em %p/p) de A (32%), B (38%) e C (30%). Considerando que B tem o mesmo fator de resposta que E e que C tem o mesmo que D, determine os valores de área por triangulação e o teor de A na amostra. ÁREAS 4) Uma amostra de 3 substâncias A, B e C foi analisada cromatograficamente, obtendo-se três picos distintos. Estes picos apresentaram áreas iguais a 57,10 mm 2 , 22,30 mm 2 e 12,40 mm 2 respectivamente. Calcule a porcentagem de B na amostra, levando em conta que A, B e C têm fatores de resposta iguais a 1,0; 1,5 e 2,0 respectivamente. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 36 5) 1,0 L de uma mistura de 0,537 g de n-butanol e 0,497 g de dioxano foi injetada em uma coluna carbowax em um cromatógrafo à gás com atenuação na posição (50), obtendo-se áreas de 104 mm2 para o n-butanol e 127 mm2 para o dioxano. 1,0 L de uma mistura desconhecida das mesmas substâncias forneceu em atenuação (10) as áreas de 400 mm2 e 228 mm2, respectivamente. Determine a concentração % v/v de cada solvente na mistura desconhecida. Dados de densidade (g/mL) : n-butanol= 0,810; dioxano= 1,034. 6) Deseja-se quantificar, por CG, uma determinada amostra, para tanto pesou-se 4,28 g da amostra e diluiu-se com solvente adequado a 250,00 mL. Injetou-se 1,5 L e obteve-se áreas de 23678 para A, 18245 para B e 3228 para C. Sabendo-se que os fatores de resposta, determinados a partir do cromatograma de uma solução com pesos conhecidos de A, B e C, são fA=1,60; fB=1,00 e fC=1,23, responda os ítens abaixo, considerando que a amostra contem somente A, B e C. a) O teor de A na amostra é ____________%. b) A massa de B presente na amostra é __________g. c) Em uma solução padrão com concentrações iguais de A, B e C, a área maior deverá ser a da substância _________. 7) Para analisar uma mistura de benzeno e acetona, misturaram-se massas iguais de cada substância e 1,50 L desse padrão foram injetados num cromatógrafo a gás, obtendo-se dois picos distintos nas condições utilizadas. Em seguida foram injetados 3,00 L da amostra a ser analisada. As áreas obtidas foram: amostra (cm2) padrão (cm2) benzeno 20,32 12,50 acetona 35,62 15,00 a) Qual é a concentração em % p/p de acetona na amostra? b) Refaça os cálculos usando a padronização externa, ou seja, considerando apenas os dados reverentes à acetona. c) Por que nesse caso, a técnica de normalização de áreas é melhor do que a padronização externa ? CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 37 8) Um frasco de metanol foi contaminado com água. A fim de utilizar esta mistura para fins analíticos, um químico decidiu analisar por cromatografia gasosa o teor de água no MeOH. Para tanto, realizou 2 injeções com o cromatógrafo nas mesmas condições. O cromatograma (A) foi a amostra e o cromatograma (B) foi uma mistura padrão de 5,00 g de água destilada com 5,00 g de metanol PA, contendo 1,50% de água. Considerando a coluna polar, pede-se: Cromatograma A Cromatograma B a) A identificação dos picos da amostra. Justifique. b) Qual é o teor de água no metanol ? 9) Numa análise cromatográfica, foram obtidos os seguintes resultados em percentual em área a partir do integrador eletrônico: % em área A B C Padrão 1:1:1 em massa 32 40 28 Amostra 36 40 24 Sabendo-se que o volume injetado em ambos os casos foi de 1,0 L e a amostra é composta somente por A, B e C, a concentração percentual corrigida de C na amostra é _______________%. Se o volume injetado fosse 2,0 L para a amostra e 3,0 L para o padrão, a concentração percentual de A seria __________________ %. 10) Deseja-se determinar o teor de cânfora e de carvona, monoterpenos encontrados em óleos essenciais. Para tal, 2,90 g do óleo contendo cânfora e carvona foram dissolvidos e diluídos em 100,00 mL de clorofórmio PA (sol. A). Uma alíquota de 5,00 mL da sol. A foi transferida para um balão volumétrico de 100,00 mL e diluída com clorofórmio PA até o traço de aferição (sol. B). 2,00 L da sol. B foram injetados em um cromatógrafo com DIC e a área obtida no integrador pertinente à cânfora foi de 55420 e de 18020 relativa à carvona. Uma solução padrão de cânfora e de carvona contendo 3,58 g e 4,05 g de cada substância, foi preparada diluindo-as em b.v. de 100,00 mL em clorofórmio PA (sol. C). Em seguida, uma alíquota de 10,00 mL da sol. C foi transferida para um b.v. de 100,00 mL e avolumada em clorofórmio PA (sol. D). Depois misturou-se 20,00 mL da sol. D e 50,00 mL de clorofórmio PA (sol. E). Injetou-se 1,00 L da solução E e as áreas de cânfora e de carvona foram 40877 e 43001. Determine o teor de cânfora e de carvona no óleo essencial. CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 40 13) Um analista deseja determinar a concentração de água residual em THF (tetraidrofurano) comercial por cromatografia gasosa. O cromatograma A é relativo à amostra de THF comercial, onde está assinalado o pico correspondente à água. A fim de escolher um padrão interno adequado, foram coinjetadas várias substâncias com a amostra e obtiveram-se os cromatogramas B (coinjeção de metanol), C (coinjeção de acetona), D (coinjeção de glicerol) e E (coinjeção de etanol). Após optar pelo EtOH como padrão interno, o analista preparou vários padrões contendo EtOH e H2O diluídos em THF anidro e obteve os cromatogramas F, G, H , I e J. a) A partir dos dados contidos na tabela abaixo e da curva de calibração, determine a concentração de água no THF comercial em ppm. b) Justifique a escolha do EtOH como padrão interno. solução analisada Área dos picos (mm2) EtOH H2O C (ppm) EtOH C (ppm) H2O vol. inj. (L) cromatograma amostra 22,9 23,2 25 ? 1,0 E padrão 1 23,0 3,0 25 5,0 1,0 F padrão 2 23,0 8,2 25 10 1,0 G padrão 3 22,5 20,3 25 25 1,0 H padrão 4 22,7 28,7 25 35 1,0 I padrão 5 23,4 41,5 25 50 1,0 J Curva de calibração de água em THF Padronização interna 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 0 10 20 30 40 50 Conc. de água (ppm) S á gu a / S e ta no l CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 41 14) Desejando determinar o teor de ácido láurico (C12H24O2) em óleo de milho, um analista optou pela técnica de cromatografia gasosa. Procedeu ao tratamento da amostra, pesando 1,250 g do óleo de milho e dissolvendo-o em CHCl3, completando o volume a 100,00 mL em balão volumétrico (sol. A). Em seguida, uma alíquota de 2,00 mL foi tratada com excesso de diazometano9, misturada com 2,00 mL de uma solução a 0,0500 g/L de amilato de metila (substância que o óleo de milho não contém) e diluída em balão volumétrico até 100,00 mL com CHCl3 (sol. B). Injetou-se 1,5 L da solução B no cromatógrafo, obtendo um cromatograma complexo, onde a área correspondente ao laurato de metila foi 15900 e ao amilato de metila foi 15850. Injetou-se, também, 1,0 L de uma solução padrão contendo 2,30 ppm de laurato de metila e 1,00 ppm de amilato de metila, obtendo-se áreas de 10950 e 11720, respectivamente. Determine o teor de ácido láurico no óleo de milho. 15) Um alcoólatra teve morte súbita provocada após a injestão de whisky falsificado. O laudo médico deu como causa da morte intoxicação por metanol. O químico do laboratório tinha, portanto, que dosar o metanol na bebida para servir de prova no processo de falsificação. Fez-se uma solução contendo 50,0 mg/mL de MeOH em EtOH puro ( sol. A) e outra contendo 40,0 mg/mL de benzeno em EtOH puro (sol. B). A partir dessas soluções foram preparados padrões em balão volumétrico de 100,00 mL (ver os volumes de alíquota correspondentes na tabela abaixo). Pesou, então, 10,3520 g do whisky, adicionou 20,00 mL da solução B e avolumou a 100,00 mL com etanol puro (sol. H). Injetou-se 1,0 L dos padrões C, D, E , F e G e da solução H, obtendo-se as seguintes áreas pelo integrador eletrônico: Solução Solução A (mL) Solução B (mL) Área de MeOH Área de benzeno C 10,00 20,00 4050 8114 D 20,00 20,00 6120 8120 E 30,00 20,00 8200 8105 F 40,00 20,00 10010 8100 G 50,00 20,00 12120 8090 H - 20,00 7200 8050 a) Determine graficamente o teor de metanol no whisky. b) Por que as áreas correspondentes ao benzeno em todas as soluções analisadas não são exatamente as mesmas, apesar das concentrações serem iguais? Explique, também, porque isso não afeta o cálculo quantitativo. 9 Diazometano (CH2N2) é um reagente que transforma, quantitativamente, ácidos carboxílicos nos respectivos ésteres metílicos derivados. A reação é: R-COOH + CH2 N2 RCOOCH3 + N2 CEFET Química – RJ – Análise Instrumental Apostila de Cromatografia em Fase Gasosa 2003 42 G. BIBLIOGRAFIA 1-Carol, H. C., Braga, G. L.; Bonato, P. S.; Introdução a Métodos Cromatográficos, Ed. UNICAMP, Campinas, 4a Ed., 1990 2-Ciola, R.; Introdução à Cromatografia em Fase Gasosa, Ed. Edgard Blucher, São Paulo, 1973 3-Kennedy, J. H.; Analytical Chemistry - Principles, Harcourt Brace Jovanovich, Flórida, 1984 4-Willard, H.; Merritt, Jr. L.; Dean, J.; Análise Instrumental, Fundação Calouste Gulbenkiam, Lisboa, 2a Edição, 1979 5-Ohlweiler, O. A.; Fundamentos da Análise Instrumental, L.T.C., Rio de Janeiro, 2a Edição, 1976 6-Ewing, G. W.; Métodos Instrumentais de Análise Química, Vol. I e II, Ed. Edgard Blucher, São Paulo, 1972. GABARITO Item B: 1 – O que mais interage com a fase estacionária e/ou tem menor pressão de vapor. 3 – C 4 – sujeira na seringa ou impureza depositada na coluna. 5 – A) injeção de padrões e comparação de Tr. B) Intensidade da luminosidade da chama. Item C: 1- C 2 - A 4 – Crom. A - maior atenuação Crom. B – maior velocidade do papel Crom. C – menor temperatura da coluna e/ou menor pressão de vapor. 5 – D 7 – A) os tempos de retenção aumentariam. B) Injetaríamos padrões de tolueno e benzeno nas mesmas condições e compararíamos os Trs. C) Os tempos de retenção diminuiriam. D) Provavelmente apareceria somente o sinal do hexano. E) Os sinais ficariam maiores e proporcionais ao fator de atenuação. 10 – A – polar B – C10, C11 e C12 C – aumentar a temperatura e/ou a vazão do gás de arraste. D – Co-injecao de padrões.